果汁中嗜酸耐热菌的检测方法及其诱导剂、显色剂

摘要

本发明涉及一种果汁中嗜酸耐热菌的检测方法及其诱导剂、显色剂。涉及的方法包括诱导培养和显色检测，其中诱导培养是利用诱导剂对待检测果汁样品进行诱导培养；显色检测是利用显色剂与经诱导培养后的待检测果汁样品进行显色反应，经显色反应后的反应体系中出现琥珀色化合物，说明待检测果汁样品中含有嗜酸耐热菌。涉及的诱导剂包括香草酸和培养基。涉及的显色剂包括具有辣根过氧化物酶活性催化活性的DNA酶和双氧水。本发明提出的基于DNA酶的快速比色检测方法，通过构建基于DNA酶的生物传感的技术，实现对该菌现场快速的定性和定量检测，具有较高的灵敏性和特异性。

说明书

技术领域

本发明涉及果汁中有害微生物的检测技术，具体涉及用于检测果汁中嗜酸 耐热菌的诱导剂、显色剂及其应用。

背景技术

嗜酸耐热菌是一种嗜酸、嗜热、好氧的芽孢杆菌，是耐热菌中主要的果汁 污染菌，其芽孢能够经受酸性果汁加工中的巴氏灭菌而存活，当其在条件适宜 的时候，又可大量繁殖，引起果汁感官和品质劣变。该菌主要污染苹果汁、橙 汁等浓缩果汁及果汁饮料，产生不良风味物质，致使果汁腐败变质，可导致生 产上的经济损失。

目前，果汁中嗜酸耐热菌检测方法主要有利用细菌培养而达到不同微生物 之间被分离的培养基分离鉴定,根据不同微生物之间的DNA和RNA序列不同产 生的分子生物学检测方法（如PCR技术、RT-PCR方法）,依据过氧化物酶催化 化学反应带来的辣根过氧化物酶（HRP）检测方法,还有依靠高端仪器检测分离 技术的红外光谱检测等。

在上述现有的嗜酸耐热菌检测技术中，应用较多的是细菌分离培养和生化 鉴定的方法，但该方法存在检测指标多、操作复杂、耗时、检测结果滞后等缺 点，导致在果汁生产过程中不能及时反馈果汁的污染状况而采取相应防措施。

此外，依靠像红外光谱检测一类的传统仪器检测具有检测灵敏高，检测结 果稳定性好等优点，但是大型仪器设备昂贵、需要具备相关知识的专业技术操 作人员、存在检测成本高昂、检测结果较慢等缺点，极大限制了大型仪器设备 的大规模应用于现场快速检测。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种果汁中嗜酸耐热菌的检测方法，以解决现 有的检测方法存在的检测速率低、特异性差和成本高的问题。

为此，本发明提供的果汁中嗜酸耐热菌的检测方法，其特征在于，包括以 下步骤：

诱导培养：利用诱导剂对待检测果汁样品进行诱导培养；所述诱导剂包括 香草酸和培养基，所述培养基为402培养基、YSG培养基、BSSA培养基、BAT 培养基或K氏培养基。

显色检测：利用显色剂与经诱导培养后的待检测果汁样品进行显色反应， 经显色反应后的反应体系中出现琥珀色化合物，说明待检测果汁样品中含有嗜 酸耐热菌；所述显色剂包括DNA酶和双氧水。

所述香草酸和培养基的用量为：l毫升待检测果汁样品需使用0.1～0.17 克的香草酸和100毫升培养基。

所述DNA酶包括单链核酸序列5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3'、氯化血红素、 氯化钾或氯化铵、氯化钠、pH为5的醋酸钠-醋酸缓冲液。

所述双氧水用量为：4mM双氧水：50μL，

所述DNA酶的组份为：

0.3μM单链核酸序列5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3'：50μL；

1μM氯化血红素：50μL；

20mM氯化钾溶液：100μL；

150mM氯化钠溶液：100μL；

pH为5的醋酸钠-醋酸缓冲液：600μL。

所述诱导培养的条件为：20～60℃，培养13～15个小时。

所述显色检测的条件为：20～30℃、15～45分钟。

所述待检测果汁样品中的糖度为8～12°Brix。

进一步，本发明提供的果汁中嗜酸耐热菌的检测方法包括以下步骤：

（1）制作嗜酸耐热菌浓度与紫外吸收强度之间的标准曲线：

（2）测定待检测果汁样品中嗜酸耐热菌的含量：包括利用上述诱导剂对 待检测果汁样品进行诱导培养，利用上述显色剂与经诱导培养后的待检测果汁 样品进行显色反应，检测显色反应体系的紫外吸收值，和，从标准曲线上读取 待检测果汁样品中嗜酸耐热菌的含量。

本发明的又一目的在于提供一种用于检测果汁中检测嗜酸耐热菌的诱导 剂，该诱导剂为上述几种诱导剂中的一种。

本发明的又一目的之一在于提供一种用于检测果汁中检测嗜酸耐热菌的 显色剂，该显色剂为上述几种显色剂的一种。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明提出的基于DNA酶（DNAzyme）的快速比色检测方法，通过构建基 于DNA酶（DNAzyme）的生物传感的技术，实现对该菌现场快速的定性和定量 检测，具有较高的灵敏性和特异性。

附图说明

图1为不同菌浓度样品诱导反应时愈创木酚的代谢曲线；

图2为实施例2中不同菌浓度对应的显色反应结果；

图3为实施例2中不同菌浓度菌对应的显色反应体系的吸光度图谱；

图4为实施例2的标准曲线。

具体实施方式

本发明所述的DNA酶是指能够在酸性条件下,催化过氧化氢氧化愈创木酚 产生琥珀色化合物四聚愈创木酚的一种酶。

本发明所用的单链核酸序列5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3'可以形成G四分 体结构，在氯化钾存在条件下，这种G四分体可以结合氯化血红素形成DNA酶 (DNAzyme)。该酶可以催化双氧水和愈创木酚之间的化学反应。

本发明所使用的培养基具体可选用402培养基、YSG培养基、BSSA培养基、 BAT培养基、K氏培养基等可用于培养嗜酸耐热菌培养的培养基。其中固体培 养基用于菌计数，液体培养基则用于菌的培养代谢。其中402培养基的配方如 下：二水合氯化钙0.25g、七水硫酸镁0.50g、硫酸铵0.20g、磷酸二氢钾3.00g、 酵母浸提物2.00g、葡萄糖5.00g；七水硫酸锌0.10g、四水氯化锰0.03g、硼 酸0.30g、六水氯化亚钴0.20g、二水氯化铜0.01g、六水合氯化镍0.02g、钼 酸钠0.03g；无菌水1000mL；

已知在添加有香草酸的培养基中,嗜酸耐热菌可以利用香草酸进行自身代 谢活动,产生愈创木酚。

酸性条件下,过氧化氢在DNAzyme的催化作用下氧化愈创木酚产生琥珀色 化合物四聚愈创木酚。该琥珀色化合物四聚愈创木酚可用肉眼观察,具体通过 与空白对照管(空白对照为未添加香草酸导致最终没有愈创木酚生成)观察琥 珀色。且该琥珀色化合物四聚愈创木酚在波长为420nm处具有较强的紫外可见 光吸收峰，且其含量不同紫外吸收强度也不同。

由此，可通过将含有嗜酸耐热菌的果汁样品在适当条件下培养后进行显色 反应，接着判断反应体系是否产生琥珀色化合物来实现对嗜酸耐热菌的定量检 测。

发明人基于到上述机理，利用DNAzyme技术对果汁中的嗜酸耐热菌进行快 速检测。

首先，本发明人考虑如何才能诱导果汁中的嗜酸耐热菌产生愈创木酚，设 计了不同添加量的香草酸作为诱导剂，促使果汁中的嗜酸耐热菌在培养中能够 产生愈创木酚而被DNA酶检测。发明人发现当香草酸添加量小于0.1克（每100 毫升培养基中）时，嗜酸耐热菌能生长繁殖但是没有愈创木酚产生，得出小于 0.1克（每100毫升培养基中）的香草酸不能作为诱导剂添加量被使用；当香 草酸添加量大于0.17克（每100毫升培养基中）时，嗜酸耐热菌不能生长繁 殖也不能产生愈创木酚，得出大于0.17克（每100毫升培养基中）的香草酸 也不能作为诱导剂添加量被使用；当香草酸添加量在0.1～0.17克（每100毫 升培养基中）时，嗜酸耐热菌能正常生长并产生愈创木酚，可以用于DNA酶检 测。

为了进一步确定具体诱导嗜酸耐热菌产生愈创木酚的诱导反应时间，无菌 操作将嗜酸耐热菌（DSM3922，保藏于德国菌种保藏中心）接种到液体402培 养基中（100mL培养基中含0.17克香草酸作为诱导剂），45℃振荡培养条件下 培养，培养过程中每间隔2h，无菌操作取1mL液体培养基，5000rpm离心5min， 取上清液，测定在270nm处紫外吸收峰，作出培养时间与愈创木酚产生量的动 态监控图。如图1所示，在0.17克香草酸作为诱导剂条件下，通过对培养嗜 酸耐热菌产生愈创木酚整个动态过程进行监控，本发明发现，当嗜酸耐热菌培 养14h后，不同初始菌浓度的嗜酸耐热菌产生明显不同量的愈创木酚，且此时 间点（14h）产生的不同量的愈创木酚足以通过显色反应进行判断，为此，可 以根据本发明提供的显色方法进行不同嗜酸耐热菌菌浓度的定性定量检测。另 一方面，能够保证在较短时间内实现对嗜酸耐热菌的快速检测，本发明提供的 培养嗜酸耐热菌14h后检测，有利于实现这种快速检测的需求。因此，本发明 选择13～15h作为监测点。

本发明利用显色剂形成DNA酶的理论依据（在合适条件下，G富集的DNA 碱基序列可以自发形成G四分体的结构，当存在钾离子的条件下，钾离子有助 于稳定这种G四分体结构。一旦加入氯化血红素，其将和钾离子稳定的G四分 体结合，最终形成氯化血红素-G-四分体的DNA酶），通过调控反应缓冲液pH 值（如醋酸钠-醋酸缓冲液）、氯化血红素和G富集序列的浓度来影响DNAzyme 形成和催化反应。从而选择合适的DNAzyme催化调控愈创木酚-双氧水反应体 系，以利用反应后产生琥珀色化合物的紫外吸收值，判断DNAzyme在不同条件 下催化愈创木酚-双氧水反应体系的氧化反应效果。

以下是发明人提供的具体实施例，以对本发明的技术方案作进一步解释说 明。

实施例1：

该实施例是对果汁样品中嗜酸耐热菌的定性检测。

该实施例的待检测果汁样品为够买于果汁企业刚加工的糖度为70°Brix 浓缩苹果汁，用无菌水稀释该果汁至糖度为8-12°Brix。

诱导剂为：100毫升402培养基+0.17g香草酸。

诱导培养：将1毫升待检测果汁样品加入诱导剂中45℃条件下、摇床振 荡培养14h后，用无菌移液管取细菌培养液1mL，5000rpm离心5min，取上清 液。

显色剂为：DNAzyme与50μL的4mM的双氧水。其中DNAzyme是将50μL 的0.3μM单链核酸序列（5'-GTGGGTAGGGCGGGTTGG-3'）（购买于生工生物工程 （上海）股份有限公司）、50μL的1μM氯化血红素、100μL的20mM氯化钾 溶液、100μL的150mM氯化钠溶液添加到600μL的25mM醋酸钠-醋酸缓冲液 （pH5.0）中,孵育30min,形成DNAzyme。

显色反应：50μL获得的上清液与显色剂反应15min。之后通过肉眼观 察反应体系颜色变化，通过与空白对照管对比，发现反应体系中有琥珀色化合 物生成，说明果汁中含有嗜酸耐热菌。

实施例2：

该实施例是对果汁样品中嗜酸耐热菌的定量检测。

该实施例的待检测果汁样品、诱导剂、显色剂与实施例1相同。

制作嗜酸耐热菌浓度与紫外吸收强度之间的标准曲线：

（1）准备试验菌种样品

无菌操作，将嗜酸耐热菌（DSM3922，保藏于德国菌种保藏中心）菌株接 种到三角瓶中，45℃条件下，上摇床振荡培养24h，作为试验菌种样品。

（2）制备初始菌悬液

无菌操作，将（1）步骤中获得的试验菌种样品5000rpm离心5min，弃去 上清液后，用10mL无菌水混匀菌体，作为菌悬液。

无菌操作，移取菌悬液1mL，放入装有9mL无菌水的试管中，使菌液充 分振荡混匀，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10-¹稀释液；再用1mL 无菌吸管，吸取10^-1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次， 让菌液混合均匀，即成10^-2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10^-2稀释液1mL， 移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，即成10^-3稀释液；以此类推，连 续稀释，制成10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9等一系列稀释菌液。再用三支 1ml无菌吸管分别吸取10^-4、10^-5、和10^-6的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好 号的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml。最后，将平板倒置于45℃恒温培养箱中 培养24h，计算出菌悬液浓度为10⁸cfu/mL，10^-8稀释菌液为初始菌悬液。

（3）不同菌浓度样品制备

无菌操作移取初始菌悬液1mL，放入装有9mL无菌水的试管中，使菌液 充分振荡混匀，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10^-1稀释液；再用1mL 无菌吸管，吸取10^-1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次， 让菌液混合均匀，即成10^-2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10^-2稀释液1mL， 移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，即成10^-3稀释液；以此类推，连 续稀释，制成10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9等一系列稀释菌液。得到10⁵cfu/mL、 10⁴cfu/mL、10³cfu/mL、10²cfu/mL菌浓度。分别编好号，备用。

（4）诱导反应

用1mL无菌吸管分别吸取10⁵cfu/mL、10⁴cfu/mL、10³cfu/mL、10²cfu/mL 等一系列稀释菌液各1mL，分别添加到装有等量诱导剂的三角瓶中，在45℃ 条件下，进行该菌摇床培养，培养14h。

（5）显色反应

取50μL经诱导反应后的嗜酸酸耐热菌离心上清液添加到显色剂中,孵育 45min,观察不同菌浓度样品的颜色变化。如图2所示，不同初始浓度的嗜酸耐 热菌最终在DNAzyme反应体系中产生明显区别于空白对照的琥珀色，且不同浓 度的初始加入菌浓度的嗜酸耐热菌产生颜色不一样。

（6）吸光度检测

检测不同菌浓度样品显色反应体系的吸光度值，检测结果如图3所示。

以该实施例步骤（1）中不同浓度的嗜酸耐热菌为横坐标，其相应的显色 反应体系紫外吸收值为纵坐标，制作标准曲线，如图4所示。

检测实施例1中的显色反应体系的吸光度，利用该吸光度在图4所示标准 曲线上查取待检测果汁样品中菌的含量为112cfu/mL。

对比例：

该对比例是采用传统的细菌培养分离方法对实施例1中的果汁样品进行检 测。

（1）初始果汁实际样品的液体培养

在无菌操作条件下，用无菌移液管移取1mL果汁样品，加入液体402培养 基中，在45℃条件下，上摇床振荡培养18h后，5000rpm离心5min，弃去上清 液，此时用10mL无菌水稀释管内菌体，制成菌悬液备用。

（2）菌悬液固体培养

无菌操作移取初始菌悬液1mL，放入装有9mL无菌水的试管中，使菌液 充分振荡混匀，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10^-1稀释液；再用1mL 无菌吸管，吸取10^-1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次， 让菌液混合均匀，即成10^-2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10^-2稀释液1mL， 移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，即成10^-3稀释液；以此类推，连 续稀释，制成10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9等一系列稀释菌液。再用三支 1ml无菌吸管分别吸取10^-4、10^-5、和10^-6的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好 号的无菌平皿中，每个平皿放0.2ml。最后，将平板倒置于45℃恒温培养箱中 培养24h，观察平板中的菌落形态特征。

（3）结果判定

平皿中有单菌落出现且出现菌落较大，边缘光滑，突起，粘稠，易挑起， 呈拉丝状的菌落特征，判断出果汁中含有嗜酸耐热菌，与实施例1的检测结 果一致。