猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌疫苗制备及鉴定方法

摘要

本发明公开了一种猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌疫苗制备及鉴定方法，通过全基因合成带有接头的猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因，将其定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中，构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18，电穿孔转化长双歧杆菌(

说明书

技术领域

本发明涉及猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌疫苗制备及鉴定方法。

背景技术

猪囊尾蚴病（Cysticercosis cellulosae）又称囊虫病（Cysticercosis），是由猪带绦虫（Taenia solium）的中绦期幼虫寄生在人体皮下、肌肉、脑、眼等脏器引起的一种严重危害人类健康的人畜共患寄生虫病，已成为全球性的公共卫生问题，我国也是猪囊尾蚴病高发国家之一，以东北、华北、西北、西南地区发病率较高，全国约有200万～300万囊虫病患者，感染率为0.14%～3.20%。药物及手术治疗都有其局限性，研制疫苗防治该病已成为当前研究热点。

TSO45W-4B和TSOL18基因是猪带绦虫六钩蚴阶段两个重要的免疫原基因，被认为是最具前景的疫苗候选基因。由于宿主MHC分子的多样性和猪带绦虫抗原成分的复杂性，宿主将针对抗原的多个表位产生免疫反应，使得单一抗原成分诱导宿主产生的保护性免疫应答效果往往较低，因此，多种抗原的融合，综合各种抗原分子的协同作用，可能有助于克服单一抗原成分作为候选疫苗的不足，基于这样的思路本研究致力于猪带绦虫中免疫及保护效果肯定的两种抗原TSO45W-4B、TSOL18编码基因的融合疫苗研制。

双歧杆菌(Bifidobacteria,Bb)是人和哺乳动物肠道内重要的益生菌，具有抗菌、抑瘤、免疫调节和营养等多种生理作用。近年来，随着基因工程技术的发展，以Bb为载体传递系统，已在细菌、病毒、肿瘤等领域构建了一系列重组双歧杆菌。而在寄生虫领域方面，尚未见猪带绦虫重组Bb的报道，因此，本研究拟通过全基因合成带有接头的猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因，将其定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中，构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18，电穿孔转化长双歧杆菌(B.longum)，构建猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗，为猪囊尾蚴病的防治提供一种有价值的新型疫苗。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：通过全基因合成带有接头的猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因，将其定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中，构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18，电穿孔转化长双歧杆菌(B.longum)，构建猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗，为猪囊尾蚴病的防治提供一种有价值的新型疫苗。

本发明的技术方案是：一种猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌疫苗制备及鉴定方法，包括以下步骤：（1）TSO45W-4B-TSOL18融合基因合成和引物设计：根据猪带绦虫TSO45W-4B和TSOL18基因序列，将TSO45W-4B和TSOL18基因片段用甘氨酸接头（Gly4Ser）3 linker连接，通过全基因合成的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端分别加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点和保护性碱基，合成长度为789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因；

（2）重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的构建及鉴定：合成基因的PCR产物与克隆载体pMD18-T在T4DNA连接酶作用下，连接，连接产物转化至E.coli Top10感受态细胞，冰浴，水浴，冰浴冷却后加入LB培养液，振摇，离心，弃上清，剩余200μl混匀涂于含Amp的LB琼脂平板上，倒置培养12～16h；挑取单菌落至含氨苄青霉素的LB培养液中，振摇培养，提取质粒，进行PCR鉴定；然后将重组质粒pMD18-T-TSO45W-4B-TSOL18与表达载体pGEX-1λT分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，胶回收相应片段后用T4DNA连接酶16℃连接，转化至E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，抽提质粒，进行酶切和测序鉴定；

（3）猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗的构建及鉴定

①B.longum感受态细菌的制备：将B.longum冻干粉用无菌水充分溶解后，涂布于MRS琼脂平板上，厌氧培养24～72h，使其充分活化；挑取活化的单菌落，接种于MRS液体培养中厌氧培养；然后按1:25比例接种于含蔗糖的MRS培养基中，厌氧培养24～72h；冰浴，离心，弃上清，沉淀用预冷的蔗糖清洗，再用蔗糖缓冲液重悬；此细菌可立即用于电转化，或者加入预冷的甘油，-80℃冻存备用；

②重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转化B.longum感受态细菌：取备用的重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18与B.longum感受态细菌混匀，冰浴10～15min后转移至电击杯中，电击完毕后立即将混合液转入到MRS液体培养基的EP管中，厌氧培养；将菌液涂布于含氨苄青霉素的MRS琼脂平板上，厌氧培养24～72h；

③猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗的鉴定：挑取上述平板中单个菌落至含氨苄青霉素的MRS培养基的EP管中，厌氧培养24～72h；将菌液离心，弃上清，沉淀中加入蔗糖溶液重溶菌体沉淀，温浴，期间振荡使其充分反应；抽提质粒，进行酶切、PCR和测序鉴定。 

步骤②中所述的电击参数设置为：电压1.25KV、场强12.5 KV/cm、电容25μF、电阻200Ω、转化时间5ms。

本发明达到的有益效果：通过全基因合成猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因，将该融合基因定向克隆到大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pGEX-1λT中，构建重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18，电穿孔法将该质粒导入Bb，构建猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗，通过酶切、PCR和测序进行鉴定，证明成功构建了猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗。本发明的疫苗是一种新型疫苗，具有许多优点：①构建的重组Bb疫苗是活疫苗，可在体内长期存活并不断表达外源抗原，单次接种即可持续诱导对靶抗原的反应，产生持久的免疫应答；②运用分子生物学手段，通过对靶抗原的剪切或修饰，可使新型疫苗理想化；③Bb本身具有广泛的生理活性，因此，在作为疫苗应用的同时，Bb能够发挥本身具有的益生功能，达到一剂多用的目的；④生产简单，所表达的保护性抗原不需纯化，无需佐剂，可直接用于免疫接种，免去了蛋白质后处理的复杂工序，从而大大降低了疫苗的成本，适于大批量生产；⑤接种途径方便，可采用滴鼻、口服等人群易接受的途径进行免疫；⑥鉴于Bb具有公认的安全性和独特的可口风味，疫苗可通过添加到酸奶等饮料中的方法进行应用，可望成为广大人群预防、控制猪囊尾蚴病的一种安全可靠的崭新手段和途径。因此，选择人体正常菌群的双歧杆菌(Bb)为载体，构建猪带绦虫的重组Bb疫苗，可能是预防和控制猪囊尾蚴病较为安全、有效的一种新型疫苗,将该疫苗用于流行区人猪囊尾蚴病的防治具有重大的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的双酶切鉴定，其中 1：DNA分子质量标准；2：重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的双酶切产物；

图2为重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的测序鉴定；

图3为B.longum中重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的双酶切鉴定，其中M：DNA分子质量标准；1：重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18；2：重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的双酶切产物；

图4为B.longum中重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的PCR鉴定，其中M：DNA分子质量标准；1～7：双歧杆菌中重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的PCR产物；

图5为 B.longum中重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的测序鉴定。

具体实施方式

本发明的猪带绦虫TSO45W-4B-TSOL18融合基因重组双歧杆菌疫苗制备及鉴定方法，包括以下步骤：

（1）TSO45W-4B-TSOL18融合基因合成和引物设计：根据猪带绦虫TSO45W-4B和TSOL18基因序列，将TSO45W-4B和TSOL18基因片段用甘氨酸接头（Gly4Ser）3 linker连接，通过全基因合成的方法，设计全长拼接引物，在引物的两端分别加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点和保护性碱基,由上海英俊生物技术有限公司合成长度为789bp的TSO45W-4B-TSOL18融合基因。 

（2）重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的构建及鉴定：合成基因的PCR产物与克隆载体pMD18-T在T4DNA连接酶作用下，16℃连接过夜，连接产物转化至E.coli Top10感受态细胞，冰浴30min，42℃水浴90s，冰浴冷却后加入900μlLB培养液，37℃225rpm振摇45 min，离心，弃上清400μl左右，剩余200μl混匀涂于含50μg/mlAmp的LB琼脂平板上，37℃倒置培养12～16h。挑取单菌落至含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37℃225rpm振摇培养过夜，提取质粒，进行PCR鉴定。然后将重组质粒pMD18-T-TSO45W-4B-TSOL18与表达载体pGEX-1λT分别用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，胶回收相应片段后用T4DNA连接酶16℃连接过夜，转化至E.coli DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆，抽提质粒，进行酶切和测序鉴定。

重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的酶切鉴定：

重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳，得到4944 bp的pGEX-1λT载体片段和789bp(351bp+45bp+393bp=789bp）的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段，与预期结果相符（图1）。

重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的测序鉴定：

合成的TSO45W-4B-TSOL18融合基因，亚克隆到pGEX-1λT载体的BamHⅠ和EcoRⅠ位点，测序结果与预期序列100%匹配（图2）。

（3）猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗的构建及鉴定

①B.longum感受态细菌的制备：将购买的B.longum冻干粉用无菌水充分溶解后，涂布于MRS琼脂平板上，37℃厌氧培养24～72h，使其充分活化；挑取活化的单菌落，接种于4mlMRS液体培养中，37℃厌氧培养至菌体OD600nm值为0.5左右；按1:25比例接种于含0.5M蔗糖的MRS培养基中，37℃厌氧培养24～72h；冰浴30min，4℃10000r/min离心1min，弃上清，沉淀用预冷的0.5M蔗糖清洗2次，再用100μl0.5M蔗糖缓冲液重悬；此细菌可立即用于电转化，或者加入预冷的15%甘油，-80℃冻存备用。

②重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18电转化B.longum感受态细菌：取备用的重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL181μg与B.longum感受态细菌100μl混匀，冰浴10～15min后转移至至1mm的电击杯中，电击参数设置为：电压1.25KV、场强12.5 KV/cm、电容25μF、电阻200Ω、转化时间5ms；电击完毕后立即将混合液转入到900μlMRS液体培养基的EP管中，37℃厌氧培养2h；将菌液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的MRS琼脂平板上，37℃厌氧培养24～72h。 

③猪带绦虫重组Bb(pGEX-TSO45W-4B-TSOL18)疫苗的鉴定：挑取上述平板中单个菌落至1ml含100μg/ml氨苄青霉素的MRS培养基的EP管中，37℃厌氧培养24～72h；将菌液4℃10000r/min离心5min，弃上清，沉淀中加入250μl 25%蔗糖溶液重溶菌体沉淀，37℃温浴30min，期间每隔5min振荡1次，使其充分反应；抽提质粒，进行酶切、PCR和测序鉴定。

B.longum中重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的酶切鉴定：

从具有氨苄青霉素抗性的B.longum中抽提的重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18，经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳，得到4944 bp的pGEX-1λT载体片段和789bp(351bp+45bp+393bp=789bp）的TSO45W-4B-TSOL18融合基因片段，与预期结果相符（图3）。

 B.longum中重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的PCR鉴定：

以从具有氨苄青霉素抗性的B.longum中抽提的重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18为模板进行PCR扩增可得到888bp的基因片段，除去载体序列99bp，TSO45W-4B-TSOL18融合基因实际的长度为789bp，与预期结果相符（图4）。

B.longum中重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18的测序鉴定：

从具有氨苄青霉素抗性的B.longum中抽提的重组质粒pGEX-TSO45W-4B-TSOL18，其测序结果与预期序列100%匹配（图5）。