小麦与沙融山羊草远缘杂交后代中Y型高分子量谷蛋白亚基基因的分子标记及其应用

摘要

本发明提供了小麦与沙融山羊草远缘杂交后代中Y型HMW-GS基因的分子标记，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物扩增得到。利用该引物进行PCR反应能够快速准确地检测小麦远缘杂交杂种中是否含有沙融山羊草Y型HMW-GS基因位点，从而判断小麦与沙融山羊草远缘杂交后代中是否存在Y型HMW-GS基因。本方法能够准确检测出小麦杂种中沙融山羊草Y型HMW-GS基因是否转移与存在，方便跟踪该基因，大大提高育种工作效率，加快小麦品质育种的进程，在小麦的杂交育种领域具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及分子遗传学领域，特别是涉及小麦与沙融山羊草远缘杂交后代中沙融山羊草Y型高分子量谷蛋白亚基（high molecular weight glutenin subunit，HMW-GS）基因的分子标记及其应用、用于PCR方法扩增分子标记的特异性引物，本发明还涉及利用该引物进行小麦远缘杂交后代杂种的鉴定及品种（系）的选育。 

背景技术

小麦的遗传改良进程中，通过远缘杂交能够把小麦野生近缘野生物种的特异有利基因导入普通小麦，进而改变小麦的遗传组成，有效改良小麦的农艺性状，因此，广泛应用于小麦育种中。山羊草属物种作为小麦的野生近缘属种，因具有优异的抗条锈、叶锈、秆锈病、白粉病，耐旱、耐盐碱、耐寒、高蛋白等控制抗病、抗逆、优质和高产重要农艺性状基因，是小麦遗传改良的重要外源优异基因供体。高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)是小麦胚乳中的重要贮藏蛋白，占小麦总储藏蛋白的10%左右，是小麦面粉加工品质的重要决定因素。在普通小麦及其近缘物种中，高分子量谷蛋白亚基由位于第l部分同源群染色体长臂的单个基因位点所控制，每一个HMW-GS基因位点上都包含2个紧密连锁的基因，其中分子量较大的称为X型亚基，分子量较小的称为Y型亚基。已有的研究表明，普通小麦本身含有的HMW-GS的类型较少，而在小麦近缘属物种中含有大量新的HMW-GS变异类型。 

沙融山羊草（Aegilops sharonensis,2n=14,S^shS^sh）是小麦的近缘物种之一，具有许多优良的抗病、抗逆及品质基因，并被用来作为 亲本通过远缘杂交的方式对普通小麦进行遗传改良。从沙融山羊草中克隆鉴定出的新的高分子量谷蛋白Y型亚基基因，是非常独特的等位基因变异类型，其编码的蛋白亚基分子量远大于普通小麦的Y型亚基基因分子量。高分子量谷蛋白亚基大小与组成直接影响小麦的加工品质，通常高分子量谷蛋白亚基分子量越大，小麦面粉的加工品质越好。因此，通过远缘杂交将沙融山羊草中的谷蛋白亚基转移到普通小麦，将对普通小麦的品质改良产生正效应。 

在外源目标基因导入小麦的过程中，对被转移的基因或染色体片段进行准确、快速的鉴定和追踪，将会提高选择的有效性，从而缩短育种周期，提高育种效率。因此，对导入小麦的外源染色体、染色体片段或所携带的外源基因进行有效鉴定将是远缘杂交育种过程中十分重要的环节。目前，鉴定外源染色体的常用方法主要包括形态学鉴定和细胞学鉴定。形态学分析通过观察比较杂种F1植株与亲本在形态学上的异同而做出鉴定；细胞学鉴定通过核型分析，染色体配对分析，C-带技术等对杂种F1进行鉴别。此外，原位杂交技术也被广泛用于外源染色体或片段的鉴定。 

然而，形态学鉴定虽然直观，但受经验等主观因素影响以及某些目标性状无法通过形态表现出来而具有相当大的局限性；而细胞学鉴定与原位杂交都必须通过培育杂种成植株，对季节与取材时间要求严格，且分析鉴定方法较复杂，对技术、操作及实践经验要求高，而且因为是从染色体水平上进行的鉴定，由于细胞分裂过程中存在着染色体片段的交换与丢失，很难断定目标性状基因是否真实存在与正常表达。因此，在连续实施杂交选育新品种（系）材料的过程中有必要建立一种简单、高效、快速的检测沙融山羊草与小麦远缘杂交杂种中属于沙融山羊草Y型谷蛋白亚基基因的方法。据此，我们根据已知的沙融山羊草高分子量Y型谷蛋白亚基基因序列，开发了特异性引物，不但鉴定出了以沙融山羊草为亲本的不同杂交及 回交后代材料中属于沙融山羊草Y型亚基的编码基因条带，而且运用此标记引物能在连续的杂交世代中追踪检测沙融山羊草Y型谷蛋白亚基基因的转移情况，这将会极大的促进对远缘杂交后代的研究工作并且加快品种（系）选育的进程。 

发明内容

本发明的第一个目的在于提供小麦与沙融山羊草远缘杂交后代中Y型高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）基因的分子标记。 

本发明的第二个目的在于提供用于检测沙融山羊草Y型HMW-GS基因的引物。 

本发明的第三个目的在于提供鉴定小麦远缘杂交杂种中是否有沙融山羊草Y型谷蛋白亚基基因的方法，加快小麦品种的选育进度。 

基于以上目的，本发明根据Jiang et al.（BMC plant biology2012，12:73）对沙融山羊草的研究结果，从NCBI数据库中获得沙融山羊草高分子量Y型谷蛋白亚基完整的编码基因（GenBank登录号为JN001486），并对基因序列结构进行分析。运用DNAMAN6.0软件对沙融山羊草Y型谷蛋白亚基编码基因及二粒小麦，普通小麦中常见的HMW-GS基因进行序列比对分析，鉴定出位于沙融山羊草Y型HMW-GS基因序列中第36bp与第38bp处的SNP位点，与其他亚基基因比较，是由C→A，T→C。同时，根据Primer Premier5.0软件分析结果，在位于起始密码子ATG下游第20-40bp和242-262bp处设计了一对包含SNP位点的检测沙融山羊草Y型HMW-GS基因的特异性引物。因此本发明提供了小麦与沙融山羊草远缘杂交后代中Y型HMW-GS基因的分子标记，其由下列引物对RY1经PCR扩增获得。 

上游引物序列，5’-TCTTTGCGACAGTAGTAACCG-3’（SEQ ID NO.1） 

下游引物序列，5’-ATTGTCTTGCGACTTGGCTGA-3’（SEQ ID  NO.2）。本发明提供了上述分子标记在小麦杂种选育中的应用。 

本发明的分子标记可用于筛选含有沙融山羊草Y型HMW-GS基因的小麦杂种。 

本发明提供了上述分子标记在检测小麦与沙融山羊草远缘杂交后代中Y型HMW-GS基因中的应用，是用引物RY1进行PCR方法扩增待检测小麦基因组DNA，如果用引物RY1能够扩增出243bp的扩增片段，则说明该待检小麦与沙融山羊草远缘杂交后代中存在Y型HMW-GS基因，所述RY1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。 

本发明提供了检测小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草Y型HMW-GS基因的引物，即RY1 

上游引物序列，5’-TCTTTGCGACAGTAGTAACCG-3’（SEQ ID NO.1） 

下游引物序列，5’-ATTGTCTTGCGACTTGGCTGA-3’（SEQ ID NO.2）。 

进一步地，提供了上述引物在检测小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草Y型HMW-GS基因的应用。 

进一步地，提供了上述引物在小麦杂交鉴定中的应用。 

进一步地，提供了上述引物在小麦杂种选育中的应用。 

本发明提供了一种检测小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草Y型HMW-GS基因的方法，用引物RY1进行PCR方法扩增待检杂交小麦基因组DNA，如果用引物RY1能够扩增出243bp的扩增片段，则说明该待检小麦存在Y型谷蛋白亚基基因，所述RY1引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。 

其中，所述PCR方法的反应程序为：预变性94～95℃，5～8min；94～95℃变性45～60s，60～63℃退火30～40s，71～73℃延伸40～50s，共30～35个循环；终延伸71～74℃8～10min。 

优选地，所述PCR方法的反应程序为：预变性94℃，5min；94℃变性45s，61℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；终延伸72℃8min。 

本发明提供了上述方法在小麦育种中的应用。 

本发明还提供了一种检测小麦远缘杂交杂种中Y型HMW-GS基因的试剂盒，其含有引物RY1，序列分别为 

上游引物序列，5’-TCTTTGCGACAGTAGTAACCG-3’ 

下游引物序列，5’-ATTGTCTTGCGACTTGGCTGA-3’。 

本发明提供的上述试剂盒，还含有阳性对照模板，所述阳性对照模板为含有Y型HMW-GS编码基因的质粒。 

本发明所开发的沙融山羊草高分子量Y型谷蛋白亚基基因的特异性引物，直接对杂交后代材料进行目的基因的扩增检测，不但能从基因分子水平上对杂交后代的真假做出判断，而且在连续的自交与回交育种过程中能够追踪检测基因的转移与存在，并且鉴定方法简单，结果可靠，弥补了形态学鉴定的粗放，细胞学鉴定的繁琐等不足，这对通过远缘杂交育种来改良普通小麦来说将是一种很好的辅助育种手段。利用本发明的鉴定方法，将使后续研究更具目的性与针对性。 

附图说明

图1为远缘杂交组合Z639×R7后代F1与普通小麦CN16回交后代（BC1）SDS-PAGE电泳检测图，Z639为野生二粒小麦，R7为沙融山羊草，CN16为普通小麦川农16，BC1F1-1、2、3、4、5表示所获得BC1F1代的种子，其中，实线箭头表示属于沙融山羊草的Y型高分子量谷蛋白亚基，虚线箭头表示普通小麦CN16中与沙融山羊草Y型亚基有相似大小的亚基，虚实线箭头表示存在于回交后代中的可能属于沙融山羊草Y型亚基或普通小麦亚基或两者共同亚基存在。 

图2为利用RY1引物对杂交后代进行基因特异性扩增的检测 图，其中，M2为DNA markerII（由下往上条带大小依次为：100、300、500、700、900bp），Z639为野生二粒小麦（杂交母本），R7为沙融山羊草（杂交父本），F1、F2、BC1F1及相应数字分别代表杂交子一代、F1自交后代和回交子一代所得种子编号，L3、CN16为回交轮回亲本六倍体小麦良麦3号和川农16，其中，BC1F1-1/2/3/4/7/9为远缘杂交组合Z639×R7后代F1与普通小麦川农16的回交后代植株；BC1F1-11/12/15/18/19/20为远缘杂交组合Z639×R7后代F1与普通小麦良麦3号的回交后代植株。 

图3为引物RY1分别检测远缘杂交F1，F2，BC1F1扩增片段克隆测序的序列比对图。JN001486为沙融山羊草中Y型高分子量谷蛋白亚基基因在GenBank的登录号，R7为沙融山羊草的扩增片段序列，F1-1为R7与Z639杂交F1代植株的扩增片段序列，F2-1和F2-7是F1自交后代F2植株的扩增片段序列，BC1F1-1，BC1F1-4，BC1F1-15为回交F1代植株的扩增片段序列，RY1-F为上游引物，RY1-R为下游引物。 

图4为对RY1引物对进行特异性验证的PCR检测图，其中，M2为DNA markerⅡ，R7为沙融山羊草，编号1-4分别代表4个四倍体小麦：Z636、Z639、S24、S31，编号5-11分别代表7个普通小麦：川农16、良麦2号、良麦3号、良麦4号、绵麦37、川重组104、中国春。 

图5为非特异性引物PCR扩增检测图，a图为引物R-Y1的检测图，b为引物R-Y2的检测图，其中，R7为沙融山羊草，Z639为野生二粒小麦，CN16、L3为普通小麦品种川农16和良麦3号，F1，F2，BC1F1-1、4、11、18分别表示杂交一代，F1自交后代和回交子一代植株。 

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明 的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明所使用的四倍体野生二粒小麦：Z639、S24、S31，四倍体硬粒小麦Z636，六倍体小麦：川农16（CN16）、良麦2号、良麦3号（L3）、良麦4号、绵麦37、川重组104、中国春，以及二倍体沙融山羊草R7，均可从四川农业大学小麦研究所得到。本发明所用生化试剂均为市售。本发明各试剂配方如下： 

蛋白提取缓冲液配方为：62.5mM Tris-HCL pH6.8，2％(W/V)SDS，10％(V/V)甘油，1.5％(W/V)DTT，0.002%(W/V)溴酚蓝。 

染色液配方为：0.001%考马斯亮蓝R-250（W/V），10%冰醋酸，25%异丙醇；脱色液配方为：10%冰醋酸，25%异丙醇。 

凝胶制备方法为：采用不连续缓冲系统，分离胶用12%SDS-PAGE（pH8.9），浓缩胶用3%SDS-PAGE（pH6.8）； 

聚丙烯酰胺凝胶配方： 

其中Resolving gel缓冲液配方：1.25M Tris-HCL，1%SDS（W/V），3.8%（W/V）硼酸，pH8.9；Stacking gel缓冲液配方：1.0M Tris-HCL，pH6.8，10%SDS（W/V）；电极缓冲液配方：将Resolving gel缓冲液稀释10倍。 

实施例1沙融山羊草Y型谷蛋白亚基基因SNP分子标记及其检测引物的确定 

根据文献（Jiang Q T,Ma J,Wei Y M,et al.Novel variants of HMW glutenin subunits from Aegilops section Sitopsis species in relation to evolution and wheat breeding.BMC Plant Biology,2012,12:73.）对沙融山羊草的研究结果，从NCBI数据库中获得沙融山羊草Y型HMW-GS完整的编码基因，并对基因序列结构进行分析。本发明对沙融山羊草Y型谷蛋白亚基编码基因及二粒小麦，普通小麦中普遍存在的HMW-GS基因（沙融山羊草谷蛋白Y型亚基编码基因登录号为JN001486；二粒小麦，普通小麦中常见亚基为1Ax、1Ay、1Bx7、1By8、1Dx2、1Dx5、1Dy10、1Dy12，其编码基因GenBank号分别为EF055262、FJ404595、BK006773、AY245797、BK006460、HM050419、EU287437、BK006459）进行序列比对分析，确定出沙融山羊草高分子量Y型谷蛋白亚基编码基因序列36bp和38bp处的SNP位点，即在起始密码子下游36bp与38bp处，与其他亚基基因比较，是由C→A，T→C。结合引物设计软件，在沙融山羊草Y型高分子量谷蛋白亚基编码基因20-40bp和242-262bp处设计了一对沙融山羊草Y型亚基基因的特异性引物RY1，其核苷酸序列如下： 

上游引物：5’-TCTTTGCGACAGTAGTAACCG-3’； 

下游引物：5’-ATTGTCTTGCGACTTGGCTGA-3’。 

预期扩增产物大小为243bp的片段，其碱基序列见SEQ ID NO.9所示。本发明的分子标记可用于鉴定小麦与沙融山羊草远缘杂交后代中是否含有Y型HMW-GS基因，特异性引物RY1可用于PCR扩增该分子标记。 

实施例2小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草Y型HMW-GS基因检测方法的建立 

1、小麦远缘杂交杂种的获得与鉴定 

以四倍体野生二粒小麦（Z639）为母本，进行人工去雄（剪去上部老的小穗和基部太嫩的小穗，只留中间10-15个小穗，套袋）。3d后授以新鲜的沙融山羊草（R7）花粉（剪取正在扬花的穗子，抖动花药落入去雄的母本小花上），然后套袋直到收获，得到少量种子。 

取上述远缘杂交所得的种子每粒用刀将其横切成两半，取含有胚乳的半粒种子研磨成细粉，置于1.5ml的离心管中，按每毫克细粉加25μl蛋白提取缓冲液于室温下浸提2.5h，期间涡旋混匀3次；将浸提后的样品在沸水中煮8min，8000r/min离心5min，上清液即为蛋白提取样品。 

吸取蛋白提取样品8μl点样，采用BIO-RAD的Mini-PROTEANTetra System电泳仪进行电泳，用Tris-硼酸作电极缓冲液，恒流20mA电泳，待溴酚蓝跑出分离胶25min后结束电泳，电泳大概需要3h。 

电泳结束后，取下胶，将凝胶置于有染色液的大培养皿中进行染色，并将大培养皿放在摇床，轻摇染色，染色2～3h；染色后，用蒸馏水或者脱色液脱色至背景清晰，此时即可观察，照相或做成干胶长期保存； 

2、F1(Z639×R7)与六倍体小麦的回交种子的获得与鉴定 

为实现将沙融山羊草中的高分子量谷蛋白亚基向普通小麦转移而达到品质育种的目的，按照步骤1中的去雄授粉方法以真杂种F1(Z639×R7)为母本，六倍体普通小麦CN16和L3为父本进行杂交，将所得到的种子进行蛋白提取，凝胶电泳与观察，方法同上述步骤1；F1(Z639×R7)×CN16种子的SDS-PAGE杂种鉴定结果显示沙融山羊草的Y型亚基在回交后代种子中可能得到遗传，也可能丢失（图1）。 

出现外源基因丢失的原因在于，远缘杂交后代染色体在低世代整合的不够稳定，在细胞分裂时，容易导致杂交亲本的某些性状基因的变异或丢失，从而造成这些性状在后代的缺失。因此，为了在远缘杂交后代中持续跟踪检测外源目的基因，开发一套基因特异分 子标记从DNA水平来鉴别外源遗传物质有无（真假杂种）是快速、高效的方法。同时，由图1可看出，对于沙融山羊草R7中（Y型亚基）与轮回亲本（普通小麦）有相似大小的谷蛋白亚基时（图中箭头所示），通过SDS-PAGE无法直接区分其来自小麦背景还是外源沙融山羊草，要确定其准确来源，必须借助基因特异分子标记。 

3、基因组DNA提取 

将经过SDS-PAGE检测后的真杂种F1，F1自交后代F2，F1与普通小麦回交后代BC1F1及其亲本种植于田间，待生长茂盛时取叶片进行基因组DNA提取。提取方法采用CTAB法，提取步骤如下： 

a)将检测后的杂交种子种植，植株长大后取2g新鲜幼嫩叶片，液氮研磨成细粉后加预热至65℃的CTAB提取液(2%CTAB；1.4M NaCl；0.1M Tris-HCl，pH=8.0；0.1M EDTA，pH=8.0；使用前加2%β-巯基乙醇)15ml，混匀。 

b)65℃水浴40min，其间轻摇混匀。 

c)冷却至室温后加等体积的氯仿：异戊醇(24∶1)，轻轻混匀至上清液呈牛奶状，4000r/min离心10min。 

d)取上清液，加等体积异丙醇，置于冰浴中沉淀DNA。 

e)勾出DNA，用70%酒精洗2次，无水乙醇洗一次，吹干DNA，溶于适量pH=8.0的1×TE溶液中。 

f)琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度及质量。 

4、PCR特异性扩增 

采用实施例1的引物对上述各种子的基因组进行PCR扩增。 

RY1上游引物：5’-TCTTTGCGACAGTAGTAACCG-3’； 

下游引物：5’-ATTGTCTTGCGACTTGGCTGA-3’。 

PCR反应体系： 

PCR反应程序： 

RY1引物扩增片段长度为243bp。 

扩增结果见图2，将扩增产物测序后，其序列如SEQ ID NO.9所示，在线BLAST，显示扩增的243bp的片段属于沙融山羊草Y型高分子量谷蛋白亚基。结合图2和BLAST结果，说明本发明的引物RY1能特异性扩增沙融山羊草Y型高分子量谷蛋白亚基编码基因中的片段，通过从BC1F1中能够扩增出目的片段从而确定外源沙融山羊草Y型亚基存在于BC1F1中，进而将真假杂种区分出来。 

5、特异片段的验证： 

使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（TIANGEN）进行PCR产物的回收与纯化。扩增产物回收并纯化后连接到T载体，按照pMD19-T试剂盒（TaKaRa）使用说明书进行，反应液于16℃水浴连接过夜。转化大肠杆菌感受态细胞，挑取培养过夜的平板上生长良好的白色单菌落，在含有氨苄青霉素（50μg/mL）的LB固体培养基平板上划线，扩大培养（37℃培养5h）。挑取重组菌进行PCR扩增，扩增使用载体上的引物M13: 

M13F(RV-M):5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’ 

M13R(M13-47):5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’ 

PCR反应液总体积为25μL，其中含10×PCR buffer2.5μL，4种dNTP各200μmol/L共2μL，引物（50μM）各0.5μl，0.65U Taq酶，少许白斑菌体。PCR反应程序同上。获得阳性克隆后，送大连宝生物公司进行测序，测序结果序列比对见图3，表明利用RY1引物在杂种以及回交后代中扩增的片段序列与沙融山羊草Y型谷蛋白亚基基因目标区域序列完全一致。进一步说明本发明建立的检测小麦远缘杂交杂种中Y型谷蛋白亚基基因的方法准确、可靠。 

实施例3检测小麦远缘杂交杂种中沙融山羊草Y型HMW-GS基因引物的特异性验证 

为确保本发明所开发的引物能够真正检测到沙融山羊草Y型HMW-GS基因的转移与存在，有必要对引物的特异性进行验证。 

验证例1：按照实施例2中的植物基因组DNA提取方法及PCR扩增方法，提取4个四倍体小麦（Z636、Z639、S24、S31，由四川农业大学小麦研究所提供），7个普通小麦（川农16、良麦2号、良麦3号、良麦4号、绵麦37、川重组104、中国春，由四川农业大学小麦研究所提供）的基因组DNA并利用所设计的引物RY1进行PCR扩增检测，扩增检测方法同实施例2； 

扩增检测结果见图4，由图可看出，本发明的引物只能在沙融山羊草（R7）中扩出目的条带，而在其他材料（4个四倍体小麦和7个普通小麦品种）中没有扩增出任何条带，因此进一步表明，所开发的检测沙融山羊草高分子量Y型谷蛋白亚基编码基因引物特异性良好，达到100%特异，能够在小麦育种中进行应用。由此说明，利用本发明提供的引物能够准确跟踪并检测出含有沙融山羊草Y型谷蛋白亚基基因的小麦杂种，从而有利于大大提高小麦育种效率。 

验证例2：以沙融山羊草Y型HMW-GS基因（登录号JN001486）序列为模板，在其编码基因区段随机设计了一对引物R-Y1，同时， 

在本发明确定的特异位点上设计了另一对与RY1不同的引物R-Y2，其核苷酸序列分别如下： 

R-Y1：上游引物：5’-AACTTCTCCGCAGCAGGA-3’； 

下游引物：5’-ATCAGCTGTGTCGTGGGCT-3’。 

R-Y2：上游引物：5’-TCTTTGCGACAGTAGTAA-3’； 

下游引物：5’-ATTGTCTTGCGACTTGGC-3’。 

按照实施例2中的植物基因组DNA提取方法及PCR扩增方法，提取R7，F1，BC1F1，CN16，L3的基因组DNA并用引物R-Y1，R-Y2分别进行PCR扩增检测，扩增检测方法同实施例2； 

扩增检测结果见图5，由图5的a图可看出，非特异位点上所设计的引物R-Y1要么扩增不出目的条带，要么扩出除目的条带外的其他条带；同时，在本发明所确定的特异位点上设计的另一对引物R-Y2虽然与RY1相比仅少了三个碱基，但从图5的b图可看出，R-Y2能在非含Y型HMW-GS基因的材料中均扩出与R7材料相同的条带。可见，随机引物和在特异位点设计的两种引物均不特异，无法作为检测沙融山羊草Y型HMW-GS基因的特异性引物使用，由此表明，本发明设计的沙融山羊草Y型HMW-GS基因的特异性标记引物RY1是在进行反复筛选和验证，舍弃了大量的不适宜的引物，综合比对并验证其特异性的情况下最终确定的，同时再一步证明了本发明所开发的引物是特异与稳定的。 

虽然，上文已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。