一种用于快速筛选雌二醇的磁性纳米粒子

摘要

本发明涉及一种用于快速筛选雌二醇的磁性多孔纳米粒子。它是以正硅酸乙酯为硅源，十六烷基三甲基溴化铵为模板剂，通过反应在Fe3O4纳米粒子表面包覆多孔的SiO2（Fe3O4/mSiO2）；在HP-β-CD上接上能与羟基脱水缩合的羧基；然后以碳二亚胺为脱水剂，使Fe3O4/mSiO2粒子表面上的羟基与HP-β-CD修饰的羧基经脱水缩合制备Fe3O4/mSiO2/HP-β-CD纳米粒子。该方法反应条件温和，产物分散稳定性好、使用寿命长；产物具有类过氧化氢酶活性和多孔性，具有较高的催化活性，能快速筛选与识别食品、环境样品中的雌二醇；操作简单，方便推广应用，可广泛地应用于食品、环境样品中痕量雌二醇的高能量筛选。

说明书

技术领域

本发明属于材料技术领域，涉及一种具有类酶活性的磁性纳米粒子，具体 涉及一种筛选检测雌二醇的磁性纳米粒子，可直接应用于食品、环境样品中痕 量雌二醇的分析。

背景技术

β-雌二醇是一种类固醇甾体雌激素，是卵巢成熟滤泡分泌的一种自然雌激素， 生理性强，极微小的量（5～282ng/L）在体内发挥调节生理机能的作用。把雌激 素添加在饲料中喂养动物可以显著促进畜类的增产作用（梁润，成都理工大学， 2012）。通过非自然分泌的渠道进入人体的雌激素可干扰人体内分泌、生殖、免 疫和神经系统的正常作用，甚至引发乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等癌症，威胁人 类的健康（刘永华等，中国畜牧兽医，2011，38（7）：239-241）。

目前，食品安全性问题日益受关注，国内外对食品与环境中雌激素含量的检 出限越来越低，因此检测要求越来越高。β-雌二醇作为雌激素中活性最强的一种， 在食品与环境中的痕量筛选与检测显得尤为重要。当前β-雌二醇的筛选与检测方 法主要有：高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱法(GC-MS)及液相色谱-质 谱法(LC-MS)等（戴小华等，中国农学通报，2005，21（5）：131-183；刘芳等， 解放军预防医学杂志，2011，29（5）：383-386）。但是，这些方法存在仪器设备 复杂、测试操作人员技术要求高且不能现场采样测试等缺点，不利于生产实践中 大规模的推广应用。为解决此问题，有人提出酶联免疫法（刘珒等，食品科学， 2012，33（8）：146-150；胡双庆等，上海师范大学学报，2011，40（6）：591-596）， 该方法简便、快捷，但存在酶的价格昂贵，难保存，易失活的缺点，使实际应用 受到限制。天然酶的这些缺点促使生物化学家们研究并寻求具有天然酶催化功能 的模拟酶，如卟啉类模拟酶（Traylor T G,Xu R.J.Am.Chem.Soc.,1987,109 (20):6201-6202）、冠醚（Peterson B R,et al.Chem.Biol1995,2(3):139-146）、环 糊精（Liu Y.et al.Acc.Chem.Res.2006,39(10):681-691）及杯芳烃（袁立华等， 有机化学,1992,2(6):583-584）等，但这些传统的模拟酶存在难分离、难回收、 难再生；催化活性位点单一，催化效率低等缺点。中科院生物物理研究所阎锡蕴 研究小组发现磁性氧化铁纳米粒子具有内在的过氧化物模拟酶活性（Gao等,Nat. Nanotechnol.2007,2(9):577-583）。因纳米粒子比表面积大，表面活化中心多，催 化活性和催化效率高而使磁性纳米模拟酶的研究备受关注（Ding等，Analytical  Chemistry，2012，82：5897-5899；聂冬霞，华东师范大学，2011；高原，吉林 大学，2012）。

目前，Fe₃O₄模拟酶的研究局限于只模拟酶的辅基结构，且裸露的Fe₃O₄容易 团聚、易失活，催化活性不如天然酶（梁敏敏等，东南大学学报，2011，30：105-107； 郭祖鹏等，磁性材料及器件，2012，43：9-19）。因此，制备分散稳定性高、使用 寿命长及类酶活性高的Fe₃O₄的纳米粒子具有十分重要的意义。徐琰清用SiO₂包裹 Fe₃O₄制备了四氧化三铁/二氧化硅复合颗粒，有效地阻止了Fe₃O₄粒子之间的团 聚，增加了其分散稳定性（徐琰清，华东师范大学，2011）；Zhang等采用普鲁士 蓝对磁性纳米粒子表面进行修饰来提高其催化活性（Zhang X,et al.J Mater. Chem.,2010,20:5110-5116）；Su等人（Su等,Analytical Chemistry,2012, 84:5753-5758）和Shi等人（Shi等,Chem.Commun.,2011,47:10785-10787）通过 贵金属掺杂的磁性纳米粒子来提高其催化活性，如ZnFe₂O₄、CoFe₂O₄纳米粒子。 β-环糊精具有“内疏水，外亲水”的筒状刚性结构，尺寸适宜的客体分子可进入其 内腔形成包合物，是广泛使用的传统模拟酶。目前文献报道的环糊精修饰磁性纳 米粒子多用于食品、环境样品中待测组分的分离和富集,有关其类过氧化物酶活 性的研究以及在雌二醇快速检测中的应用，尚未见文献报道。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种多孔、分散性好、 类酶活性高、稳定、使用寿命长的Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD磁性纳米粒子，可广 泛地应用于食品、环境样品中痕量雌二醇的高能量筛选。

本发明所述的Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD磁性纳米粒子，是通过以下步骤来制备 的：（1）在氮气保护下，往250mL三颈烧瓶中加入摩尔比为0.4～1.0的Fe²⁺溶液和Fe³⁺溶液，搅拌，用浓氨水调节溶液pH为11，水浴反应30分钟，熟化 1小时；产物依次用蒸馏水和无水乙醇洗涤2～3次，50℃真空干燥得到Fe₃O₄粒子；（2）取质量比为1:3～1:6的Fe₃O₄和十六烷基三甲基溴化铵于圆底烧瓶 中，加入蒸馏水250mL，第一次超声波处理，加入30～50mL浓度为0.01mol/L 的NaOH溶液，摇匀，第二次超声波处理，第一次搅拌，60～80℃水浴反应30～60 分钟，滴入0.5～2mL体积比为1:2～1:6的正硅酸乙酯-乙醇溶液，第二次搅拌， 反应8～15小时；产物用强磁铁分离收集、干燥，用40～80mL浓度为5～50mg/mL 硝酸铵乙醇溶液回流萃取30～60分钟，重复萃取4～6次，除去表面活性剂， 40～80℃真空干燥24小时得到Fe₃O₄/mSiO₂纳米粒子；（3）取0.5～1.0g羟丙 基-β-环糊精（HP-β-CD）加入到已通氮除氧的20～50mL0.5mol/L柠檬酸三钠 溶液（pH=6）中，超声10～30分钟；在氮气保护下，搅拌，水浴反应10～15小 时；产物用无水乙醇洗涤、40～80℃真空干燥24小时得到羧基修饰的羟丙基-β- 环糊精；（4）取60～150mg Fe₃O₄/mSiO₂纳米粒子分散到30～80mL0.25mol/L  NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液（pH=6），第一次超声波处理，加入0.2～1.0mL浓 度为25mg/mL碳二亚胺溶液，第二次超声波处理，加入0.4～1.0g羧基修饰的 HP-β-CD，第三次超声波处理；产物用无水乙醇洗涤2-4次，40～80℃真空干燥 24小时得到所述的Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD纳米粒子。

根据本发明所述的磁性纳米粒子的进一步特征，所述步骤（1）中，Fe²⁺溶液与Fe³⁺溶液的摩尔比为0.55～0.65。

根据本发明所述的磁性纳米粒子的进一步特征，所述步骤（1）中，所述搅 拌是采用机械搅拌方式，搅拌速度为600r/min，水浴温度为80℃。

根据本发明所述的磁性纳米粒子的进一步特征，所述步骤（2）中，Fe₃O₄与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1:5～1:6，所加入的NaOH溶液为30mL。

根据本发明所述的磁性纳米粒子的进一步特征，所述步骤（2）中，所述搅 拌采用机械搅拌方式，第一次搅拌速度为400～600r/min，第二次搅拌速度调节 为800～1000r/min。第一次超声波处理时间为30～50分钟，第二次超声波处理 时间为3～6分钟。

根据本发明所述的磁性纳米粒子的进一步特征，所述步骤（2）中，正硅酸 乙酯与乙醇溶液中的正硅酸乙酯与乙醇的体积比为1:4。

根据本发明所述的磁性纳米粒子的进一步特征，所述步骤（2）中，所述硝 酸铵乙醇溶液中的硝酸铵浓度为10～20mg/mL。

根据本发明所述的磁性纳米粒子的进一步特征，所述步骤（3）中，所述柠 檬酸三钠溶液中加入的柠檬酸三钠溶液20～30mL。

根据本发明所述的磁性纳米粒子的进一步特征，所述步骤（3）中，所述搅 拌采用磁力搅拌方式，搅拌速度为200～400r/min，水浴温度为60～80℃。

根据本发明所述的磁性纳米粒子的进一步特征，所述步骤（4）中，第一、 二次超声波处理时间为10～20分钟，第三次超声波处理时间为80～150分钟。

本发明的原理是：先向正硅酸乙酯的水解体系中，加入模板剂十六烷基三甲 基溴化铵，通过反应在Fe₃O₄纳米粒子表面包覆多孔的SiO₂（Fe₃O₄/mSiO₂）， 再用柠檬酸三钠修饰HP-β-CD，在HP-β-CD上接上能与羟基脱水缩合的羧基， 最后以碳二亚胺为脱水剂，使Fe₃O₄/mSiO₂粒子表面上的羟基与HP-β-CD表面 修饰的羧基经脱水缩合反应制备Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD纳米粒子。

本发明所述的快速筛选雌二醇的磁性多孔纳米粒子具有以下有益效果：

（1）反应条件温和，产品稳定性好（磁性纳米粒子放置一个月后用于催化 反应，其催化溶液的吸光值与一个月前的基本一致）、使用寿命长（循环使用 30次，其催化效果没有发生明显变化，吸光值相对标准偏差为1.05%）；

（2）具有多孔性，经计算得到的BET表面积为90cm²/g，总孔体积为0.1 cm³/g；

（3）具有类过氧化氢酶活性，且具有较高的催化活性（检出限达8.0×10^-8mol/L）；

（4）能快速筛选与识别食品、环境样品中的雌二醇；

（5）操作简单，方便推广应用。

附图说明

图1是本发明制备快速筛选雌二醇磁性纳米粒子的原理图。

图2是本发明所述的Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD纳米粒子的扫描电镜图。

图3是Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD纳米粒子的类酶活性实验结果图。图中，a曲 线是Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD纳米粒子+TMB；c曲线是TMB+H₂O₂；b曲线是 Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD纳米粒子+TMB+H₂O₂。

图4是Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD纳米粒子用于牛奶中雌二醇的快速筛选结果 图。图中，样品1（①、②）为蒙牛麦香早餐奶，样品2（③、④）为蒙牛特 仑苏，样品3（⑤、⑥）为蒙牛纯牛奶，样品4（⑦、⑧）为蒙牛新养道低脂 牛奶，样品5（⑨、⑩）为燕塘纯牛奶，样品6为伊利低乳糖低脂 奶，样品7为燕塘红枣枸杞奶，样品8为伊利谷粒多 红谷，样品9为燕塘高钙奶，样品10为蒙牛高钙奶。

图5是Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD纳米粒子用于环境水样中雌二醇的快速筛选 结果图。图中，样品1（①、②、③）为大塘面村水，样品2（④、⑤、⑥） 为肇庆学院情人湖水，样品3（⑦、⑧、⑨）为自来水，样品4（⑩、为西江水，样品5为矿泉水。

具体实施方式

实施例一：本发明所述的快速筛选雌二醇磁性纳米粒子的制备

本实施例所述的快速筛选雌二醇磁性纳米粒子的制备的原理图如图1所 示，制备方法包括以下步骤：

（1）在氮气保护下，往250mL三颈烧瓶中加入0.3mol/L Fe²⁺溶液6mL 和0.3mol/L的Fe³⁺溶液10mL，用NH₄OH溶液调节pH为11，以600r/min 机械搅拌，80℃下水浴反应30分钟，熟化1h。产物依次用蒸馏水和无水乙醇 洗涤2次，50℃真空干燥得到Fe₃O₄粒子。

（2）称取60mg Fe₃O₄和300mg十六烷基三甲基溴化铵于圆底烧瓶中，加 入蒸馏水250mL，超声30分钟，加入0.01mol/L NaOH溶液30mL，摇匀， 继续超声5分钟，然后在600r/min机械搅拌下，60℃水浴反应30分钟，滴入 2mL体积比1:4的正硅酸乙酯-乙醇溶液，调节搅拌速度到1000r/min搅拌反应 12小时。产物干燥后用60mL10mg/mL硝酸铵乙醇溶液回流萃取30分钟，重 复萃取5次，除去表面活性剂，50℃真空干燥24小时得到Fe₃O₄/mSiO₂纳米粒 子。

（3）取0.7g羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）加入到已通氮除氧的20mL0.5 mol/L柠檬酸三钠溶液（pH=6）中，超声30分钟，在300r/min磁力搅拌和氮 气保护下，60℃水浴搅拌反应12小时。产物用无水乙醇洗涤、50℃真空干燥 24小时得到羧基修饰的羟丙基-β-环糊精。

（4）取120mg Fe₃O₄/mSiO₂纳米粒子分散到50mL0.25mol/L  NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液（pH为6）中，超声10分钟，加入1mL25mg/mL 碳二亚胺溶液，再超声15分钟，加入600mg羧基修饰的HP-β-CD，并连续超 声100分钟。产物用无水乙醇洗涤3次，50℃真空干燥24小时得到 Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD磁性纳米粒子。

实施例二：本发明所述的Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD磁性纳米粒子的多孔性

扫描电镜检测：将实施例一制备得到的磁性纳米粒子通过扫描电镜进行观 察，如图2所示，可见其颗粒大小较均匀，分散性良好，表面具有多孔洞，比 表面积大。经计算得到的BET表面积为90cm²/g，总孔体积为0.1cm³/g。

实施例三：本发明所述的Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD磁性纳米粒子的类酶活性

分别往a、b、c号试管中加入等量的pH4的柠檬酸-磷酸缓冲液、四甲基联苯 胺（TMB）和双氧水（H₂O₂），再分别往b、c号试管中加入实施例一制备得到的 Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD磁性纳米粒子。各试管在40℃恒温水浴中反应30分钟，最 后只往c管中加入两滴2mol/L的H₂SO₄，得到a、b、c号试管溶液的颜色分别为无 色透明、蓝绿色和黄色。将a、b、c号试管置于冰水浴20分钟以停止反应，分别 经过紫外可见分光光度计的扫描，结果如图2。从图2可知，a号试管在400nm到 800nm之间几乎呈一条直线，b号试管则在652nm左右出现最大吸收峰，c号试管 最大吸收峰在450nm左右。该结果与辣根过氧化物酶（HRP酶）催化H₂O₂氧化 TMB产生的颜色反应现象一致，说明所述的磁性纳米粒子具有类HRP酶催化活 性。

实施例四：本发明所述的Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD磁性纳米粒子用于牛奶中雌二醇 的快速筛选

样品前处理：准确量取样品5.00mL于50mL聚苯乙烯具塞离心管中，加入 10ml乙腈和适量氯化钠(约2g)，漩涡混匀后超声提取30分钟，再以4000r/min 的转速离心15分钟，取上清液经无水硫酸钠过滤脱水，收集滤液；沉淀用5ml 乙腈重复萃取2次，合并滤液，氮吹浓缩至5mL。

实验组：在96孔U形反应板的右侧（见图4），每孔分别加入80μL经处理的牛 奶，2mg实施例一所制备的磁性纳米粒子，20μL0.01M的H₂O₂溶液和pH为4的 100μL柠檬酸-磷酸缓冲液。在30℃下，在距离反应板5-7cm处，用方形磁铁旋转 一分钟。反应完毕，加入25μL的TMB溶液，再在距离反应板5-7cm处，用方形磁 铁旋转一分钟，在40℃下继续反应10分钟，即可有明显的颜色反应。

对照组：在96孔板的最左侧（见图4），每孔均加入2mg实施例一所制备的磁 性纳米粒子、20μL0.01M的H₂O₂溶液和pH为4的180μL柠檬酸-磷酸缓冲液，在 30℃下，在距离反应板5-7cm处，用方形磁铁旋转一分钟。反应完毕，加入25μL 的TMB溶液，再在距离反应板5-7cm处，用方形磁铁旋转一分钟，在40℃下继续 反应10分钟，即可有明显的颜色反应。

通过与同一排最左侧对照组的颜色比较，可以快速筛选识别样品中是否含有 雌二醇。

结果见图4。由图4可以看出，样品1、2、3的颜色与第一排最左侧对照 组的颜色相比较，没有显著性差异，在样品1、2、3的溶液中加20μL雌二醇 标准溶液（5.0×10^-6mol/L）后，样品1、2、3加标液的颜色与第二排最左侧对 照组的颜色相比较，明显变浅，说明样品1、2、3，即蒙牛麦香早餐奶、蒙牛 特仑苏奶、蒙牛纯牛奶样品中没有检出雌二醇。同理，可以发现，样品4、5、 6的颜色与第三排最左侧对照组的颜色相比较，没有显著性差异，样品7、8、9 的颜色与第五排最左侧对照组的颜色相比较，没有显著性差异，样品10的颜色 与第七排最左侧对照组的颜色相比较，没有显著性差异，以上结果说明蒙牛新 养道低脂奶、燕塘纯牛奶、伊利低乳糖低脂奶、燕塘红枣枸杞奶、伊利谷粒多 红谷奶、燕塘高钙奶、蒙牛高钙奶样品中均没有检出雌二醇。本发明所述的磁 性纳米粒子可用于筛选牛奶样品中的雌二醇。

实施例五：本发明所述的Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD磁性纳米粒子用于环境水样中雌 二醇的快速筛选

实验组：分别对大塘面村水塘水、肇庆学院情人湖水、自来水、西江水（肇 庆市端州区江滨三路西江边）、矿泉水（鼎湖飘雪）等5个样进行雌二醇筛选。在 96孔U形反应板的右侧（见图5），每孔加入80μL的水样，2mg实施例一所制备的 磁性纳米粒子、20μL0.01mol/L的H₂O₂溶液和100μL柠檬酸-磷酸缓冲液（pH=4）， 在距离反应板5-7cm处，用方形磁铁旋转一分钟，混合、反应。然后加入25μL的 TMB溶液，同样在距离反应板5-7cm处，用方形磁铁旋转一分钟。最后将96孔U 形反应板放在40℃的恒温振荡器中振荡反应10分钟，即可有明显的颜色反应。

对照组：在96孔板最左侧（见图5），每孔均加入实施例一所制备的磁性纳米 粒子2mg、20μL0.01M的H₂O₂溶液和180μL柠檬酸-磷酸缓冲液（pH=4），在距 离反应板5-7cm处，用方形磁铁旋转一分钟，混合、反应。然后加入25μL的TMB 溶液，同样在距离反应板5-7cm处，用方形磁铁旋转一分钟，最后将96孔U形反 应板放在40℃的恒温振荡器中振荡反应10分钟，即可有明显的颜色反应。

通过与同一排最左侧对照组的颜色比较，可以快速筛选识别样品中是否含有 雌二醇。

结果见图5。由图5可以看出，样品1，2的颜色与第一排最左侧对照组的 颜色相比较，没有显著性差异，在样品1，2的溶液中分别加入20μL雌二醇标 准溶液（5.0×10^-6mol/L）后，加标液的颜色与第二排最左侧对照组的颜色相比 较，明显变浅，说明样品1，2，即大塘面村水和学校情人湖水中没有检出雌二 醇。同理，可以发现，样品3，4的颜色与第三排最左侧对照组的颜色相比较， 没有显著性差异，样品5的颜色与第五排最左侧对照组的颜色相比较，没有显 著性差异，以上结果说明自来水、西江水、矿泉水样品中均没有检出雌二醇。 本发明所述的磁性纳米粒子可用于筛选环境水样中的雌二醇。

实施例六：本发明所述的快速筛选雌二醇磁性纳米粒子的制备

根据图1所示的制备原理，本发明在实施例一的基础上进行扩展实验，得 到以下的制备方法：

（1）在氮气保护下，往250mL三颈烧瓶中加入摩尔比为0.4～1.0的Fe²⁺溶液和Fe³⁺溶液（优选地，Fe²⁺溶液与Fe³⁺溶液的摩尔比为0.55～0.65），搅拌 （优选为机械搅拌，搅拌速度为600r/min），用浓氨水调节溶液pH为11，水 浴反应30分钟（优选地，水浴温度为80℃），熟化1小时；产物依次用蒸馏 水和无水乙醇洗涤2～3次，50℃真空干燥得到Fe₃O₄粒子；

（2）取质量比为1:3～1:6（优选为1:5～1:6）的Fe₃O₄和十六烷基三甲基溴 化铵于圆底烧瓶中，加入蒸馏水250mL，第一次超声波处理（优选地，处理时 间为30～50分钟），加入30～50mL（优选为30mL）浓度为0.01mol/L的NaOH 溶液，摇匀，第二次超声波处理（优选地，处理时间为3～6分钟），第一次搅 拌（优选为机械搅拌，搅拌速度为400～600r/min），60～80℃水浴反应30～60 分钟，滴入0.5～2mL体积比为1:2～1:6（优选为1:4）的正硅酸乙酯-乙醇溶液， 第二次搅拌（优选为机械搅拌，搅拌速度为800～1000r/min），反应8～15小时； 产物用强磁铁分离收集、干燥，用40～80mL浓度为5～50mg/mL（优选为10～20 mg/mL）硝酸铵乙醇溶液回流萃取30～60分钟，重复萃取4～6次，除去表面活 性剂，40～80℃真空干燥24小时得到Fe₃O₄/mSiO₂纳米粒子；

（3）取0.5～1.0g羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）加入到已通氮除氧的20～50 mL（优选为20～30mL）0.5mol/L柠檬酸三钠溶液（pH=6）中，超声10～30分 钟；在氮气保护下，搅拌（优选为磁力搅拌，搅拌速度为200～400r/min），水 浴反应10～15小时（优选地，水浴温度为60～80℃）；产物用无水乙醇洗涤、 40～80℃真空干燥24小时得到羧基修饰的羟丙基-β-环糊精；

（4）取60～150mg Fe₃O₄/mSiO₂纳米粒子分散到30～80mL0.25mol/L  NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液（pH=6），第一次超声波处理（优选地，处理时间为 10～20分钟），加入0.2～1.0mL浓度为25mg/mL碳二亚胺溶液，第二次超声 波处理（优选地，处理时间为10～20分钟），加入0.4～1.0g羧基修饰的HP-β-CD， 第三次超声波处理（优选地，处理时间为80～150分钟）；产物用无水乙醇洗 涤2-4次，40～80℃真空干燥24小时得到所述的Fe₃O₄/mSiO₂/HP-β-CD纳米粒 子。

上述方法制备得到的磁性纳米粒子，进行实施例二至五所述的实验，得到 同等的实验结果，从而证实所述方法制备的磁性纳米粒子的可行性。