水包油型乳化物、水包油型含气泡乳化物及酶分解乳蛋白混合物

摘要

提供一种水包油型乳化物，是使用乳蛋白、油脂、乳化剂及蛋白酶制备的水包油型乳化物，其特征在于，在MALDI-TOF质谱分析中，满足下面的（1）和/或（2）：（1）m/z1993-1994的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.21以上，（2）m/z2106-2107的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.15以上。由此，就可得到即使在酸性下进行搅打时也具有良好的起泡功能且在留有乳蛋白风味的同时降低了苦味的水包油型含气泡乳化物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种水包油型乳化物及一种使用其制备的水包油型含气泡乳化物，该水 包油型乳化物即使在酸性下进行搅打时也具有良好的起泡功能，并在留有乳蛋白风味的 同时降低了苦味。本发明还涉及一种酶分解乳蛋白混合物及使用其制备的水包油型乳化 物以及水包油型含气泡乳化物。

背景技术

搅打奶油(whip cream)和咖啡奶油(coffee cream)、浓缩乳等水包油型乳化物在制 糕点·制面包行业中广泛用于填充、夹心、顶饰、揉入面内。由于这些水包油型乳化物的 pH值大多数情形下均为中性，因此容易保持稳定的乳化状态，而且还容易得到搅打等的 起泡性和保形性也良好的物质。然而，该水包油型乳化物具有与以往风味相统一的缺 点。近年来，伴随着嗜好的多样化，迫切希望有混合有各种果实和果汁、酸奶等带有酸 味的酸性成分的具有清凉感的奶油类。

作为水包油型乳化物中的一种的搅打奶油在搅打时具有良好的起泡功能，搅打的结 果可得到掼奶油(whipped cream)(水包油型含气泡乳化物)。

报道了几个酸性的搅打奶油和掼奶油的含乳蛋白的例子。然而，描述了如下情形： 作为乳蛋白如果含有酪蛋白就不合适(专利文献1及2)，或者如果不在规定酪蛋白与乳 清之比的基础上进行各种混合，就不能制备目的物(专利文献3)。

为了解决这些问题，提议由作为蛋白质分解酶的蛋白酶分解乳蛋白。已知在使用胰 蛋白酶的方法(专利文献4)中，即使在酸性下也可以制成搅打奶油及掼奶油。然而，实 际制作掼奶油并通过感官试验检验风味时，由于具有非常大的苦味及涩味，因此可以断 定并不适合实际应用。此外，也有报道使用源于微生物的蛋白酶的方法(专利文献5)， 但实际制作掼奶油并通过感官试验检验风味时，虽然功能上比较充分，但由于仍然能强 烈地感受到苦味，因此可以断定并不适合实际应用。

对其原因，有人指出认为可能是蛋白酶分解而生成的多肽中，C末端一侧生成了可感 受到苦味的氨基酸(非专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第WO2005/063039号公报

专利文献2：国际公开第WO2006/035543号公报

专利文献3：日本特开平8-154612号公报

专利文献4：日本特开平2-257838号公报

专利文献5：日本特开平1-23867号公报

非专利文献

非专利文献1：J.Solms J.Agric.Food.Chem.1969，17，pp686-688

发明内容

如上所述，耐酸性的水包油型乳化物制备中虽然使用了蛋白酶，但由蛋白酶处理存 在产生苦味和涩味的问题。因此，本发明的课题在于，提供一种即使在酸性下进行搅拌 打时也具有良好的起泡功能的水包油型乳化物，该水包油型乳化物是一种可以得到在留 有乳蛋白风味的同时降低了苦味的水包油型含气泡乳化物的搅打奶油等的水包油型乳化 物。本发明的课题还在于，提供一种可成为该水包油型乳化物原料的酶分解乳蛋白混合 物。

本发明的发明人为了解决上述课题进行了深入探讨，其结果，发现通过使用蛋白酶 来制备水包油型乳化物或酶分解乳蛋白混合物就可解决上述课题，从而得到了本发明。

也就是说，本发明涉及一种水包油型乳化物及使用其制备的水包油型含气泡乳化 物，所述水包油型乳化物是使用乳蛋白、油脂、乳化剂及蛋白酶制备的水包油型乳化 物，在MALDI-TOF质谱分析中，满足下面的(1)和/或(2)：

(1)m/z1993-1994的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.21以上，

(2)m/z2106-2107的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.15以上。

本发明还涉及一种酶分解乳蛋白混合物及使用其制备的水包油型乳化物和水包油型 含气泡乳化物，所述酶分解乳蛋白混合物是使用乳蛋白及蛋白酶制备的酶分解乳蛋白混 合物，其特征在于，在MALDI-TOF质谱分析中，满足下面的(1)和/或(2)：

(1)m/z1993-1994的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.21以上，

(2)m/z2106-2107的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.15以上。

根据本发明的水包油型乳化物，就可得到即使在酸性下进行搅打时也具有良好的起 泡功能的良好的掼奶油(水包油型含气泡乳化物)。此外，根据本发明的水包油型乳化 物，可以制备在留有乳蛋白风味的同时苦味降低了的水包油型含气泡乳化物。此外，根 据本发明的酶分解乳蛋白混合物，就可制备具备上述优异性质的水包油型乳化物及水包 油型含气泡乳化物。

附图说明

图1是显示由实施例2得到的搅打奶油的MALDI-TOF质谱图谱的图。(A)蛋白酶 P“Amano”3SD(蛋白酶P“アマノ”3SD)、(B)Kokulase·P(コクラ一ゼ·P)。

图2是显示由实施例17-a得到的搅打奶油的MALDI-TOF质谱图谱的图。

图3是显示由比较例4得到的搅打奶油的MALDI-TOF质谱图谱的图。

具体实施方式

以下描述的组成条件的说明只是本发明实施方式的一个例子(代表例)，本发明不受 这些内容的限定。

本发明的水包油型乳化物是使用乳蛋白、油脂、乳化剂及蛋白酶制备的水包油型乳 化物，其特征在于，在MALDI-TOF质谱分析中，满足下面的(1)和/或(2)：

(1)m/z1993-1994的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.21以上，

(2)m/z2106-2107的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.15以上。

本发明的水包油型乳化物除了上述(1)和/或(2)外，还优选满足(3)：

(3)m/z1717-1718的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.55以上。

本发明中的“水包油型乳化物”是指在以水为主成分的水相中分散了油脂的乳化物的意 思。水包油型乳化物可以是含气泡状态或不含气泡状态中的任意一个，但即是为含气泡 状态时也是指除去该气泡的乳化物部分。此外，本发明中的“水包油型含气泡乳化物”是指 含有气泡的状态的水包油型乳化物本身的意思，通过搅打搅打奶油等水包油型乳化物得 到的掼奶油等相当于水包油型含气泡乳化物。

本发明的水包油型乳化物及水包油型含气泡乳化物通常具有耐酸性，此处的耐酸性 是指即使是酸性时也具有与中性同等的功能，即使在酸性中也不显示出水分离或成块的 状态，具体而言是指，搅打奶油的情形下，即使是酸性下与中性同样地搅打时间、膨胀 率(overrun)值良好。

作为水包油型乳化物的具体例子，可以列举搅打奶油、咖啡奶油、浓缩乳、冰激凌 等。

下面，作为水包油型乳化物的代表例，列举搅打奶油进行说明。

本发明的作为水包油型乳化物的搅打奶油是使用乳蛋白、油脂、乳化剂及蛋白酶制 备的。作为原材料，除了乳蛋白、油脂、乳化剂及蛋白酶以外，还使用水等。

对搅打奶油的水分量没有特别限制，但为了得到具有适度气泡保持率和适度硬度的 搅打奶油，通常为10～99重量％，优选30～90重量％，更优选40～80重量％。

作为油脂没有特别限定，例如可以列举：大豆油、菜籽油、棕榈油、棕榈仁油、椰 子油、玉米油、橄榄油、棉籽油、米油、葵花籽油、红花油、可可脂、乳木果油、产果 核油、娑罗双树脂(Shorea Butter)、雾冰草脂(Illipe Butter)等的植物油脂，牛油、奶 油、猪油、鱼油、马油、鲸油等动物油脂，在这些油脂中实施了选自氢加成、分馏、酯 交换的1或2种以上处理的加工油脂。搅打奶油适合使用植物油脂及其加工油脂，特别适 合使用大豆油、菜籽油、棕榈油、棕榈仁油、椰子油及其加工油脂。

油脂也可以2种以上组合使用。对油脂在水包油型乳化物中的混合量没有特别限制， 但为了得到具有适度气泡保持率和适度硬度的水包油型含气泡乳化物，通常为1～90重量 ％，优选5～70重量％，更优选20～50重量％。

作为乳蛋白，可以列举：乳清、酪蛋白、酪蛋白钠等，也可加入含这些乳蛋白的牛 乳、奶粉、脱脂奶粉。为了增强乳风味，也可追加酪蛋白或酪蛋白钠等。

对乳蛋白的混合量没有特别限制，通常为0.1～30重量％，优选0.5～10重量％，更优 选1～5重量％。

作为乳化剂，没有特别限制，例如可以列举：甘油脂肪酸酯、甘油醋酸脂肪酸酯、 甘油乳酸脂肪酸酯、甘油琥珀酸脂肪酸酯、甘油二乙酰酒石酸脂肪酸酯、山梨糖醇酐脂 肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、蔗糖乙酸异丁酸酯、聚甘油脂肪酸酯、聚甘油缩合蓖麻酸酯、 丙二醇脂肪酸酯、硬脂酰乳酸钙、硬脂酰乳酸钠、聚氧乙烯山梨醇酐单甘油酯等合成乳 化剂。此外，还可以使用皂甙、植物甾醇、卵磷脂等天然乳化剂。对这些乳化剂的混合 量没有特别限定，通常为0.01～20重量％，优选0.1～10重量％，更优选0.2～5重量％。

本发明的搅打奶油中还可根据需要，进一步混合作为油相和/或水相成分的稳定剂、 蛋白质、糖类、调味料、增香剂、着色剂、保存剂、抗氧化剂等。

在制备酸性的搅打奶油时，在上述搅打奶油的原料中附加酸性成分，并使搅打奶油 中含有酸性成分。作为为让本发明的搅打奶油变为酸性的酸性成分，可以列举：柠檬 酸、苹果酸、维生素C等天然或合成物质的水溶液或者固形物，桔子、苹果、柠檬、 梨、桃、草莓、菠萝、橙子、猕猴桃、葡萄、扁实柠檬等的果汁或/和这些果实的块，酸 奶、发酵饮料等发酵乳成分等。用酸味成分调节的pH通常为5.5以下，优选4.5以下， 更优选4.0以下。此外，对pH的下限没有限定，通常为3。虽然此处的pH实质上是指下 面说明的水相pH的意思，但优选搅打奶油或掼奶油的pH也在该范围。

本发明的水包油型乳化物(搅打奶油)使用上述乳蛋白、油脂、乳化剂及蛋白酶制 备，通常用蛋白酶分解乳蛋白进行制备。作为其制备方法，其特征在于，依次包括：油 相与含蛋白酶的水相的混合工序、预乳化工序、匀质化工序。水相通常由水、蛋白酶、 乳蛋白、乳化剂等构成。另一方面，油相通常由油脂、乳化剂等构成。此外，通常乳蛋 白和蛋白酶混合于水相中，但这些成分也可以存在于油相中。

此外，蛋白酶的添加时机任意，可以添加在已经完成的搅打奶油中，也可在制备搅 打奶油时添加。此外，虽然蛋白酶可以存在于水相、油相的任何一个中，但由于其本身 是水溶性的，因此通常存在于水相中。

混合工序、预乳化工序、匀质化工序可与水包油型乳化物以往制备方法中的各工序 同样地进行。一般来讲，预乳化工序中使用高速搅拌机(homomixer)，匀质化工序中使 用匀质机(homogenizer)。这些工序的温度只要是适于乳化及匀质化的温度就没有特别 限制，但为了有效促进蛋白酶分解乳蛋白，优选20～80℃。

此外，为了达到杀菌和失活蛋白酶的目的，优选进行加热处理。该加热工序优选在 预乳化工序和匀质化工序之间进行。通常加热温度为80-100℃，加热时间为1-10分。

将搅打奶油调为酸性时，酸味成分的混合时机只要是在蛋白酶分解处理乳蛋白之后 就是任意的，但进行加热处理的情形下，优选加热处理后，更优选匀质化工序后。

本发明的水包油型乳化物的特征在于，在MALDI-TOF质谱分析中满足下述的(1) 和/或(2)：

(1)m/z1993-1994的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.21以上，优选在 0.30以上，更优选在0.40以上；

(2)m/z2106-2107的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.15以上，优选在 0.20以上，更优选在0.25以上。

为了制备降低苦味且保留乳风味的搅打奶油和/或掼奶油，只要满足(1)和/或(2) 中的一个或者二者就可以，但优选至少满足(1)，更优选满足(1)和(2)，更优选除 了满足(1)和/或(2)还满足(3)，更进一步优选满足全部的(1)～(3)。

(3)m/z1717-1718的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.55以上，优选在 0.75以上，更优选在1.00以上。

作为MALDI-TOF质谱分析的方法，例如可以列举下面的方法。向水包油型乳化物 约1mg中加入0.05％三氟醋酸溶液1ml搅拌稀释后，将上清液通过超滤管Microcon YM- 10(密理博公司制)。进一步用ZipTipC18(密理博公司制)脱盐，用MALDI-TOF质谱 分析。作为装置，可以使用Voyager-DE STR(美国应用生物系统公司制)等，但也可使 用能够进行同样测定的装置。此外，测定条件为离子化法(基质辅助激光解吸电离)、 激光器(氮激光器(337nm))、检测离子(阳离子检测)、基质(α-氰基羟基肉桂 酸)。

上述本发明的水包油型乳化物可通过使用作为酶的特异的蛋白酶、调整蛋白酶和乳 蛋白的反应温度、反应时间等进行制备。例如，将蛋白酶的最大温度活性设为100％时， 优选用使该活性为20％以上的温度分解乳蛋白。此外，反应时间通常为10～600分，优选 20～500分，更优选30～400分。此外，为了减少有苦味的蛋白，优选含有分子量1万以上 的蛋白。

选择用于制备该搅打奶油的特异蛋白酶的依据为如下方法：解析用蛋白酶水解搅打 奶油时生成的多肽的方法。

制备水包油型乳化物时，如果是显示出上述峰值比的蛋白酶，无论是单一酶还是复 合剂都可以。此外，可以是酶制剂的主酶活性，也可以是夹杂酶，还可以是主酶的副酶 活性。

对该蛋白酶的混合量没有特别限制，通常0.1～100,000单位每100g搅打奶油，优选 10～50,000单位，更优选100～10,000单位。蛋白酶的添加量处于上述范围外时，有时难 以得到具有适度气泡保持率和适度硬度的掼奶油。

作为能够得到本发明水包油型乳化物的特异蛋白酶，是能够分解作为乳蛋白的乳清 和酪蛋白等的酶，将这些作为底物进行分解反应时，只要在MALDI-TOF质谱分析中能 够达到上述(1)及(2)中的至少一个条件、优选(1)及(2)、更优选(1)～(3)条 件的蛋白酶就没有特别限制，但优选含有内切型蛋白酶的蛋白酶。蛋白酶可为1种，也可 为2种以上的混合物。此外，优选使用源于丝状菌的蛋白酶，更优选使用源于曲霉 (Aspergillus)属细菌的蛋白酶，适于使用源于米曲霉(Aspergillus oryzae)等微生物的 蛋白酶，也可使用从米曲霉等微生物中提取的含多个蛋白酶的馏分。例如，可以使用来 自于三菱化学食品株式会社的作为制剂市售的Kokulase·P和Kokulase AT(源于 Aspergillus oryzae)(http://www.mfc.co.jp/kouso/kokulase p.htm)。

此外，可以通过使用上述蛋白酶分解乳蛋白制备酶分解乳蛋白混合物，将其与乳化 剂及油脂混合，根据需要添加酸性成分制备水包油型乳化物。

此处的酶分解乳蛋白混合物是指含有用蛋白酶分解乳蛋白得到的乳蛋白分解物的物 质。作为乳蛋白，可以列举与上述水包油型乳化物中使用的物质同样的物质。例如，通 过用蛋白酶处理脱脂奶粉，可以得到乳蛋白分解了的脱脂奶粉(酶分解乳蛋白混合 物)。该情形下，使用的所述蛋白酶分解乳蛋白，使酶分解乳蛋白混合物在MALDI-TOF 质谱分析中也满足下面的(1)和/或(2)。

(1)m/z1993-1994的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.21以上，

(2)m/z2106-2107的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.15以上。

优选除了满足(1)和/或(2)还满足(3)，更优选满足(1)和(2)，进一步优选 满足全部(1)～(3)。

(3)m/z1717-1718的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.55以上。

这些(1)～(3)比值的优选范围与上述水包油型乳化物同样。

本发明的酶分解乳蛋白混合物可与上述本发明的水包油型乳化物同样，通过使用作 为酶的特异蛋白酶、调整反应温度、反应时间等来制备。蛋白酶的具体例子和混合量、 其他的优选条件等与上述水包油型乳化物中记载的同样。此外，制备酶分解乳蛋白混合 物时，例如在水等中混悬乳蛋白和蛋白酶进行酶反应。作为混悬液中的乳蛋白浓度，例 如为0.1重量％～90重量％，优选3重量％～70重量％，更优选5重量％～30重量％的范围。 此外，混悬液中添加的蛋白酶量通常为0.00001单位～10,000单位每1g脱脂奶粉，优选 0.0001单位～1,000单位，更优选0.001单位～100单位。如果酶浓度过低，则需要长时间 的反应，有可能导致微生物污染。

此外，本发明中的1单位定义如下。

也就是说，在酪蛋白(Calbiochem公司制)1.20g中加入0.05M磷酸二钠溶液(和光 纯药株式会社制)160ml，40℃加热，完全溶解后，回到常温，用1N盐酸调到pH6，全 量为200ml。酪蛋白溶液5ml在一定温度下加热5分钟后，加入适当稀释的酶溶液1ml并 搅拌后，在同温度下反应10分钟。该混合液中加入作为除蛋白试剂的7.2w/v％三氯醋酸 溶液(和光纯药株式会社制)1ml，放置30分钟，生成的沉淀用6号滤纸(ADVANTEC 东洋株式会社制)过滤。用分光光度计测定275nm的吸光度，算出酶效价。将1分钟内 使相当于1mg酪氨酸的波长275nm吸收物质游离到除蛋白试剂可溶性馏分中的酶活性定 义为1单位。

酶反应完成时，通过加热使酶失活，优选将经过失活工序的脱脂奶粉混悬液通过冷 冻干燥进行干燥。

接下来，以掼奶油为例，对本发明的水包油型含气泡乳化物进行说明。

本发明的掼奶油可通过使上述搅打奶油中含有空气等气体进行制备。作为本发明掼 奶油的特征，可以列举无论中性还是酸性都可制备掼奶油。

将掼奶油调为酸性时，酸性成分的添加时期可任意确定，如上述那样可将搅打奶油 本身调为酸性，也可在中性下搅打后添加酸性成分。作为将本发明的掼奶油调为酸性所 用的酸味成分，与上述列举的将本发明的搅打奶油调为酸性所用的酸味成分同样。

本发明的掼奶油在后述条件下搅打2-12分、优选5-10分时，优选膨胀率值为80- 200％，用流变仪测定的硬度为30-300gf，pH为5.5以下。膨胀率值优选110-180％。硬度 优选50-200gf，更优选80-200gf。pH优选4.5以下，更优选4.0以下。此外，pH的下限 通常为3。

用流变仪测定的硬度如果过硬，就有口感变差或挤出掼奶油时的形状变差的倾向， 而如果过软，就有形状保持性变差的倾向，因此优选上述范围。另一方面，膨胀率值如 果过大，就有口感过于清淡或变得缺少风味的倾向，而如果过低，则有风味、口中熔化 感变差的倾向，因此优选上述范围。

得到的掼奶油获得上述良好的起泡状态，该起泡状态通常保持30秒以上，优选保持 1分以上。

膨胀率值的测定例如可如下地进行。即，容量100ml的烧杯中填充掼奶油测定其质 量，由下式算出膨胀率值。此时，作为装置使用kenmix搅拌机(ケンミツクスミキサ一) (株式会社爱工舍制作所，アイコ一プロKM-600型)，在温度20℃、转数400rpm的条件 下进行搅打。

膨胀率(％)＝[(测定物无气泡状态的密度(g/cm³))-(测定物气泡化状态的密度 (g/cm³))]÷(测定物气泡化状态的密度(g/cm³))×100

硬度的测定如下进行。即，在直径5.5cm、容量100ml的杯子中放入掼奶油，使用流 变仪(太阳科学株式会社(サン科学社)制“RHEO METER CR-500DX”)，以圆盘速度 20mm/min将直径30mm的圆盘状活塞(plunger)(14号)沉到掼奶油中，测定进入 5mm时的硬度(gf)。

本发明的掼奶油具有上述良好的起泡状态，该起泡状态通常保持30秒以上，优选保 持1分以上。

接着，对掼奶油的制备方法进行说明。

本发明掼奶油的制备方法的特征在于，依次包括：油相与含蛋白酶的水相的混合工 序、预乳化工序、匀质化工序、老化工序、搅打工序，及在预乳化工序与老化工序之间 的任意位置处包括蛋白酶的加热失活工序。老化工序、搅打工序可与掼奶油以往制备法 中的各工序同样地进行。

老化工序是使脂肪结晶整齐而实现老化功能的工序，优选充分冷却后放置1昼夜以 上。一般来讲，作为搅打装置，使用以kenmix搅拌机为首的搅打起泡性奶油时通用的竖 型或卧型Court搅拌机(コ一トミキサ一)等。

将搅打奶油调为酸性所用的酸味成分的混合时机如前所述的那样可以任意选择，也 可以作为搅打工序后混合的实施方式之一将掼奶油与酸味成分一起使用。例如，可以使 用前面描述的果实块作为酸味成分，与作为掼奶油的搅打奶油一起用于填充、夹心、顶 饰。

本发明中，通过在搅打奶油中含有特定的蛋白酶，不仅在中性下，在酸性下也可以 抑制搅打奶油中所含蛋白质的凝集，而且在使该搅打奶油中含有气泡时，可抑制搅打功 能的下降，可以抑制水分离和油分的分离。因此，不仅在中性下，在酸性下掼奶油中气 泡的保持率也高，且可以保持高的硬度。

对本发明搅打奶油的用途没有限定，可以用于掼奶油、咖啡奶油、浓缩乳、冰激 凌、咖啡奶等。对本发明掼奶油的用途没有特别限定，可以用于搅打奶油、喷雾 (aeroso1)式的奶油、冰激凌等。

实施例

下面通过实施例更详细地说明本发明，只要不超出其宗旨，本发明不受下述实施例 的限定。

(实施例1)蛋白酶效价测定

对作为蛋白酶的Kokulase·P(注册商标，三菱化学食品株式会社制)及蛋白酶 P“Amano”3SD(天野酶制品株式会社制)的酶效价进行测定。即，在酪蛋白 (Calbiochem公司制)1.20g中加入0.05M磷酸二钠溶液(和光纯药株式会社制) 160ml，加热到40℃完全溶解后，返回常温，用1N盐酸调到pH6，使全量为200ml。酪 蛋白溶液5ml在55℃加热10分钟后，加入适当稀释的酶溶液1ml并搅拌后，在55℃下反 应30分钟。该混合液中加入作为除蛋白试剂的7.2w/v％三氯醋酸溶液(和光纯药株式会 社制)1ml，放置30分钟，生成的沉淀用6号滤纸(ADVANTEC东洋株式会社制)过 滤。用分光光度计测定275nm的吸光度，算出酶效价。将1分钟内使相当于1mg酪氨酸 的波长275nm吸收物质游离到除蛋白试剂可溶性馏分中的酶活性定义为1U。

Kokulase·P为130,000U/g，蛋白酶P为340,000U/g。

(实施例2)搅打奶油的蛋白酶处理

将市售的植物油脂搅打奶油(Megmilk株式会社制)200g预先加热到55℃，添加溶 在水中的Kokulase·P13.1mg或蛋白酶P“Amano”3SD5mg并搅拌30分钟。酶添加量基于 实施例1的测定结果进行调整，使添加酶量为1,700U。用微波炉加热本混合物，直至内 部温度达到90℃进行酶失活。加热后用冰水急速冷却，冷藏保存。

(实施例3)感官试验

实施例2中制备的试样由6名参加者评价。评价方法如下：同时试尝1.使用 Kokulase·P、2.使用蛋白酶P“Amano”3SD这两个，对苦味和乳风味强度进行排序。评价 时期为含在口中的瞬间(前味)、口中品位(中味)、饮入后的味道(后味)三个。结 果见表1。

表1

表明，每个时期中Kokulase·P的苦味绝对地少，能够非常强地感受到Kokulase·P的 乳风味。

(实施例4)MALDI-TOF质谱分析

在实施例2中制备的试样约1mg中加入0.05％三氟醋酸溶液1ml搅拌稀释后，上清 液通过超滤管Microcon YM-10(密理博公司制)。再进一步用ZipTipC18(密理博公司 制)脱盐，用MALDI-TOF质谱分析分子量400-7,000之间。

MALDI-TOF质谱的图谱如图1所示，主峰数值化的结果如表2及表3所示。

没有使用蛋白酶的搅打奶油，在400-7,000之间没有观察到峰。两个蛋白酶之间差异 特别显著的峰值如表2所示。

表2

表2中用将使用各蛋白酶分解的蛋白的最大强度设为100时的相对活性表示强度比。 Kokulase·P中(m/z)1717-1718、蛋白酶P“Amano”3SD中(m/z)1880-1881的峰最强。 基于该结果，算出相对于1880-1881的各峰之比。结果如表3所示。

表3

此外，对与搅打奶油进行酶反应而生成的多肽用SDS-PAGE进行解析。关于分子量 10,000以上的馏分，二者之间没有观察到大的差异。

(实施例5)制备使用市售的搅打奶油的、进行了蛋白酶反应的掼奶油

将由实施例2制备的蛋白酶处理过的搅打奶油过夜老化后，作为掼奶油，对硬度和起 泡性进行评价。

将得到的搅打奶油中的200重量％放入到用冰水冷却的碗中，加入砂糖(精白砂糖) 30重量％后，添加10％柠檬酸水溶液直至pH4.0。之后，用kenmix搅拌机(爱工含制作 所株式会社制，アイコ一プロKM-600型)在412rpm、20℃下搅打得到掼奶油。肉眼观察 起泡性良好时停止搅拌器，用前述方法测定得到的掼奶油的膨胀率值及硬度，其结果如

表4所示。

表4

  Kokulase·P 蛋白酶添加时的pH 6.3 搅打时的pH 4.0 搅打时间(分) 8 膨胀率值(％) 85 硬度(gf) 60

酶处理市售的搅打奶油的情形下，也可以制备搅打奶油。

(实施例6)使用Kokulase·P制备搅打奶油及掼奶油

表5 搅打奶油及掼奶油的制备与评价

如表5所示的那样，将作为油脂的植物油脂精致棕榈油(三吉油脂株式会社制)22.5 重量％及菜籽固化油(三吉油脂株式会社制)22.5重量％、作为乳化剂的蔗糖脂肪酸酯-1 (三菱化学食品株式会社制，产品名：リヨ一ト一シユガ一エステルS-270，注册商标， HLB2)0.25重量％、蔗糖脂肪酸酯-2(三菱化学食品株式会社制、产品名：リヨ一ト一シユ ガ一エステルO-170，注册商标，HLB1)0.05重量％、甘油脂肪酸酯(理研维生素株式会 社制，产品名：エマルジ一MS，HLB4)0.05重量％及卵磷脂(辻制油株式会社制，产品 名：SLPホワイト)0.15重量％在70℃下混合溶解，作为油相。

如表5所示的那样，将作为乳蛋白的脱脂奶粉(四叶乳业株式会社(よっ葉乳業社) 制)2重量％及酪蛋白钠(恒天然日本公司(フオンテラジヤパン社)制，产品名： ALANATE180)1重量％、偏磷酸钠(国产化学株式会社制)0.1重量％、作为乳化剂的 蔗糖脂肪酸酯-3(三菱化学食品株式会社制，产品名：リヨ一ト一シユガ一エステルS-1670， 注册商标，HLB16)0.05重量％及山梨糖醇酐脂肪酸酯(理研维生素株式会社制，产品 名：ソルマンS-300V，HLB5)0.05重量％、水51.29重量％在70℃下混合溶解，作为水相。

上述水相温度调节到55℃，然后加入Kokulase·P(注册商标，三菱化学食品株式会 社制)0.0067重量％后，在此溶液中混合油相，用TK高速搅拌机(Primix株式会社制) 在55℃搅拌30分钟，进行预乳化。之后通过将预乳化得到的水包油型乳化物(搅打奶 油)用700W的市售微波炉加热3分30秒，使Kokulase·P失活。此时搅打奶油的温度为 89±3℃。

将用微波炉加热后的搅打奶油用Gaulin匀质机(A.P.V.GAULIN公司制)在70℃、 第1段80kg/cm²、第2段20kg/cm²下进行匀质化，直接在冰水中冷却到5℃，约老化18 小时。此时的乳化粒子的中间粒径用激光衍射/散射式粒度分布测定装置(堀场制作所株 式会社制，LA-920)进行测定，大概为1～10μm。

(实施例7)

[中性掼奶油的制备及评价]

在由实施例6得到的搅打奶油100重量％中加入砂糖(精白砂糖)15重量％后，用 kenmix搅拌机(爱工舍制作所株式会社制，アイコ一ブロKM-600型)在400rpm、20℃下 搅打得到水包油型含气泡乳化物(掼奶油)。搅打中暂时停止搅拌机进行取样，然后再 进行搅打，重复该操作，最长搅打15分钟。此外，暂时停止搅拌机进行取样，测定膨胀 率后，取样的掼奶油返回到搅拌机中再进行搅打，重复该操作。

由该方法得到的产品作为中性掼奶油。pH为6.5。气泡状态最好时的膨胀率值及硬度 如表6所示。此外，良好的起泡状态至少保持在起泡时间3.5～5.5分之间。

[酸性掼奶油的制备及评价]

在由实施例6得到的搅打奶油100重量％中加入砂糖(精白砂糖)15重量％后，添加 10重量％柠檬酸水溶液，使搅打前水包油型乳化物的pH为4，然后与中性搅打奶油的制 备同样地进行搅打，得到掼奶油。由该方法得到的产品作为酸性掼奶油。气泡状态最好 时的膨胀率值及硬度如表6所示。此外，至少在搅打时间4.0～7.5分之间保持良好的起泡 状态。

表6

(比较例1)

使用未进行蛋白酶分解的搅打奶油同样调为酸性时，蛋白发生凝集，发生水分离， 不能得到酸性掼奶油。

(实施例8～10)

温度、处理时间变化的搅打奶油的蛋白酶处理

将市售的植物油脂搅打奶油(Megmilk株式会社制)200g预先加热到所定的温度 (T1)，添加作为蛋白酶的溶到水中的Kokulase AT(三菱化学食品株式会社制) 13.1mg，搅拌规定的时间(M1)。此外，温度T1和时间M1如表7所记载的那样。

搅拌后，该混合物用微波炉加热，直至内部温度达到90℃，进行酶失活。加热后， 用冰水急速冷却，冷藏保存，得到蛋白酶处理过的搅打奶油。

对该搅打奶油用与实施例2同样的方法进行MALDI-TOF质谱分析。从该分析的结果 可知，算出的(1)m/z1993-1994的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比及(2)m/z 2106-2107的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比的结果如表7所示。

此外，对该搅打奶油进行了如下的评价。结果如表7所示。

<味道/感官检查>

由3名参加者对蛋白酶处理过的搅打奶油进行评价。评价方法如下：对苦味和乳风味 进行评价，“感到苦味且乳风味淡薄”的记作C、“仅微微在后味中感到苦味，乳风味微微 有点淡薄”的记作B、“基本感觉不到苦味，乳风味微微有点淡薄”的记作A、“感觉不到 苦味，有乳风味”的记作AA。

<粘度测定、耐酸性评价>

在蛋白酶处理过的搅打奶油中添加作为酸的10％柠檬酸水溶液形成pH4.0±0.2的溶 液，用粘度计(BLOOKFIELD公司制，DV-II+pro型粘度計)测定该溶液的粘度。对添 加酸时粘度为100,000cp以上的计作耐酸性不良C、10,000cp以上的计作耐酸性普通B、 小于10,000cp的计作耐酸性良好A。

(实施例11)

除了使用作为蛋白酶的Kokulase·P(三菱化学食品株式会社制)，温度T1及时间 M1如表7所记载的那样以外，与实施例8～10同样地得到蛋白酶处理过的搅打奶油。此 外，对该搅打奶油与实施例8～10同样地进行分析、评价，结果如表7所示。

(实施例12～13)

除了使用作为蛋白酶的蛋白酶M“Amano”SD(天野酶制品株式会社制)，温度T1 及时间M1如表7所记载的那样以外，与实施例8～10同样地得到蛋白酶处理过的搅打奶 油。此外，对该搅打奶油与实施例8～10同样地进行分析、评价，结果如表7所示。

(实施例14)

除了使用作为蛋白酶的蛋白酶A“Amano”SD(天野酶制品株式会社制)，温度T1 及时间M1如表7所记载的那样以外，与实施例8～10同样地得到蛋白酶处理过的搅打奶 油。此外，对该搅打奶油与实施例8～10同样地进行分析、评价，结果如表7所示。

(实施例15、16)

除了使用作为蛋白酶的蛋白酶P“Amano”3SD(天野酶制品株式会社制)，温度T1 及时间M1如表7所记载的那样以外，与实施例8～10同样地得到蛋白酶处理过的搅打奶 油。此外，对该搅打奶油与实施例8～10同样地进行分析、评价，结果如表7所示。

从实施例8～16的结果可知，满足(1)m/z1993-1994的峰强度与m/z1880-1881的峰 强度之比在0.21以上和/或(2)m/z2106-2107的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在 0.15以上的产品是在具有耐酸性的同时味道也良好的搅打奶油。

(比较例2)

除了使用作为蛋白酶的蛋白酶A“Amano”SD(天野酶制品株式会社制)，温度T1及时 间M1如表8所记载的那样以外，与实施例8～10同样地得到蛋白酶处理过的搅打奶油。此 外，对该搅打奶油与实施例8～10同样地进行分析、评价，结果如表8所示。

(比较例3)

除了使用作为蛋白酶的蛋白酶P“Amano”3SD(天野酶制品株式会社制)，温度T1及时 间M1如表8所记载的那样以外，与实施例8～10同样地得到蛋白酶处理过的搅打奶油。此 外，对该搅打奶油与实施例8～10同样地进行分析、评价，结果如表8所示。

(1)m/z1993-1994的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.21以上以及(2)m/z 2106-2107的峰强度与m/z1880-1881的峰强度之比在0.15以上这两个必要条件中的任何一个 都不满足的是虽有耐酸性但感到苦味且乳风味淡薄的搅打奶油。

(实施例17)酶分解乳蛋白混合物的制备及使用其制备搅打奶油

将脱脂奶粉(四叶乳业株式会社制)10份均匀分散于加热到55℃的脱盐水90份中。在 该液体中添加Kokulase AT(三菱化学食品株式会社制)0.025份，按表9记载的处理温度及 时间搅拌混合。得到的脱脂奶粉溶液用微波炉加热处理，直至内部温度达到89℃±2℃，然 后冷冻干燥，得到酶处理过的脱脂奶粉(酶分解乳蛋白混合物)。

表9

  加热处理温度(℃) 时间(分) 实施例17-a 55 90 实施例17-b 60 120 实施例17-c 60 240 实施例17-d 70 20 实施例17-e 70 240

在上述酶分解乳蛋白混合物(实施例17-a～17-e的各个酶分解乳蛋白混合物)约10mg 中加入0.05％三氟醋酸溶液0.7ml，通过超声波搅拌进行分散。分散液中的分子量1万以下 的成分通过超滤管(MicroconNYCO：10,000，密理博公司制)。再用ZipTipC18(密理博 公司制)脱盐，用MALDI-TOF质谱分析分子量400-7,000之间。

MALDI-TOF质谱图谱(实施例17-a)如图2所示，数值化主峰的结果如表11(添加 酶)所示。

如表12所示的那样，将作为油脂的植物油脂棕榈液油(三吉油脂株式会社制)22.5重 量％及菜籽固化油(三吉油脂株式会社制)22.5重量％、作为乳化剂的蔗糖脂肪酸酯-1(三 菱化学食品株式会社制，产品名：リヨ一ト一シユガ一エステルS-270，注册商标，HLB2)0.25 重量％、蔗糖脂肪酸酯-2(三菱化学食品株式会社制，产品名：リヨ一ト一シユガ一エステルO- 170，注册商标，HLB1)0.05重量％、甘油脂肪酸酯(花王株式会社制，产品名：エキセル VS-95，HLB3.8)0.05重量％及卵磷脂(辻制油株式会社制，产品名：SLPホワイト)0.15重 量％在70℃下混合溶解，成为油相。

作为乳蛋白分别加入实施例17-a～17-e的酶分解乳蛋白混合物2重量％，再加入偏磷酸 钠(国产化学株式会社制)0.1重量％、作为乳化剂的蔗糖脂肪酸酯-3(三菱化学食品株式会 社制，产品名：リヨ一ト一シユガ一エステルS-1670，注册商标，HLB16)0.05重量％及山梨糖 醇酐脂肪酸酯(花王株式会社制，产品名：エマゾ一ルS-10V，HLB4.7)0.05重量％、水 51.29重量％在70℃下混合溶解，成为水相。

将油相与水相用TK高速搅拌机(特殊机化株式会社制)混合后，用Gaulin匀质机 (A.P.V.GAULIN公司制)在70℃、第1段80kg/em²、第2段20kg/cm²的条件下进行匀质 化，直接用冰水冷却到5℃，老化约18小时，得到搅打奶油。此时乳化粒子的中间粒径用 激光衍射/散射式粒度分布测定装置(堀场制作所株式会社制，LA-950)进行测定，大概为 1～10μm。

在搅打奶油100重量％中加入砂糖(精白砂糖)15重量％后，在搅打前的搅打奶油中添 加10重量％柠檬酸水溶液，直至pH为4。对该液体用B型粘度计(BLOOKFIELD公司 制，DV-II)测定粘度。此外，与实施例8～10同样地进行<味道/感官检查>。结果如表13所 示。可知，使用本发明的酶分解蛋白混合物制备的搅打奶油即使在酸性下其粘度也较低，在 10,000cp以下，具有耐酸性。

(比较例4)

除了不使用蛋白酶搅拌混合以外，与实施例17同样地进行，加热处理温度如表10所示 的那样，得到(酶未处理)的脱脂奶粉。

表10

  加热处理温度(℃) 时间(分) 比较例4-a 60 120 比较例4-b 70 20 比较例4-c 70 240

与实施例17同样地用MALDI-TOF质谱进行分析。数值化主峰的结果如表11所示。

该试样在分子量400-7,000之间没有观察到峰。MALDI-TOF质谱图谱如图3所示。

(比较例5)

除了使用脱脂奶粉(四叶乳业株式会社制)代替酶分解蛋白混合物以外，与实施例17 同样地得到搅打奶油(表12)。乳化粒子的中间粒径大概为1～10μm。此外，粘度测定的结 果如表13所示。与使用本发明的酶分解蛋白混合物制备的搅打奶油相比，酸性下的粘度 高。

(比较例6)

除了将蛋白酶(Kokulase A T)的处理温度变为55℃、处理时间变为300分以外，与 实施例17同样地得到搅打奶油。峰强度之比如表11所示，粘度及味道的评价结果如表13 所示。

表11

表12

表13

  粘度(pH4)cp 味道 实施例17-a 824 B 实施例17-b 517 B 实施例17-c 703 B 实施例17-d 4500 A 实施例17-e 1770 A 比较例5 16000   比较例6 258 C

(实施例18)

在由实施例17得到的搅打奶油100重量％(使用实施例17-a～17-e的各个搅打奶油)中 加入砂糖(精白砂糖)15重量％后，在搅打前的搅打奶油中添加10重量％柠檬酸水溶液直 至pH为4，对该液体用kenmix搅拌机(爱工舍制作所株式会社制，アイコ一ブロKM-600 型)在400rpm、20℃的条件下搅打，得到掼奶油。

搅打中暂时停止搅拌机进行取样，然后再进行搅打，重复该操作，最长搅打15分钟。 此外，暂时停止搅拌机进行取样，测定膨胀率后，取样的掼奶油返回到搅拌机中再进行搅 打，重复该操作。搅打得到掼奶油。由该方法得到的产品作为酸性掼奶油。起泡状态最良好 时的膨胀率值及硬度如表14所示。每个奶油的酸性下良好的起泡状态均保持了起泡时间1 分钟以上。

表14

(比较例6)使用了未进行酶分解的乳蛋白的搅打奶油

使用由比较例5得到的脱脂奶粉制备搅打奶油，与实施例18同样地调为酸性时，油脂 发生分离的同时，蛋白发生凝集，不能得到酸性掼奶油。