用于降低荧光原位杂交法中自体荧光干扰的检体前处理方法及其试剂套组

摘要

一种用于降低荧光原位杂交法中自体荧光干扰的检体前处理方法，包含：步骤一：福尔马林固定石蜡包埋组织；步骤二：切片及烘片；步骤三：硫氰酸钠作用；步骤四：在面积24×32mm的组织加入20μl浓度5-10mg/mL第四型胶原蛋白酶或1mg/mL弹性蛋白酶，封片后于37℃作用0.5-1hr，来降解具有自体荧光特性的细胞外基质；步骤五：用胃蛋白酶在37℃作用。又本发明另提供可用于降低荧光原位杂交法中自体荧光干扰之检体前处理法的试剂套组，通过本发明来作检体前处理，可显著降低组织自体荧光现象，提高荧光探针信号与背景荧光比率，提升荧光原位杂交法的检验品质与正确性。

说明书

技术领域

本发明提供一种用于降低荧光原位杂交法中自体荧光干扰的检体前处理方法，尤指其技术上提供一种在荧光原位杂交法(FISH，Fluorescence In Situ Hybridization)的检体前处理步骤增加第四型胶原蛋白酶(collagenase type IV)或弹性蛋白酶(elastase)处理步骤，用以降低人类组织自体荧光现象，提高荧光原位杂交法荧光探针信号的解析度。 

背景技术

荧光原位杂交法(FISH)是临床诊断常使用的技术，可用于早期诊断、治疗方式的选择或监测疾病的活动。如：乳癌患者使用贺癌平(trastuzumab)治疗是依据荧光原位杂交(FISH)检测人类表皮生长因子受体-2(HER2)基因表现或当免疫组织化学染色(IHC)呈现人类表皮生长因子受体-22+(HER22+)基因时再用荧光原位杂交(FISH)做进一步确认，筛选出对药物更有疗效的患者；此外，在棘皮动物微管结合蛋白4与间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因阳性的非小细胞肺腺癌(NSCLC)患者接受间变性淋巴瘤激酶及肝细胞生长因子受体(ALK/C-met)双靶点小分子抑制剂，克卓替尼(Crizotinib)治疗的患者可达90％以上的肿瘤缩小，57％的患者获得客观缓解，因此，有效检测出棘皮动物微管结合蛋白4与间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)融合基因对于临床标靶治疗有很大的帮助和益处。 

荧光原位杂交法是在不破坏去氧核醣核酸链状结构的原则下，将双链去氧核醣核酸链通过变性原位分开，用荧光标定的去氧核醣核酸探针与单链去氧核醣核酸链进行杂交结合，最后在荧光显微镜下直接观察荧光信号，分析细胞染色体中是否存有此去氧核醣核酸探针所对应的序列。目前，常用标定去氧核醣核酸或抗体的荧光物质为FITC异硫氰酸荧光素、奥勒岗绿(Oregon green)488、光谱绿(SpectrumGreen)，由于组织具有内源性荧光基团(endogenous fluorophores)如：胶原蛋白、弹性蛋白、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH、黄素单核苷酸(FMN，Flavin mononucleotide)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD，Flavin adenine dinucleotide)及芳香族氨基酸(aromatic amino acids)，检体若带有强烈的背景自体荧光会直接影响荧光原位杂交术和免疫荧光染色判读的准确性，此类内源性物质也可吸收类似短波长光而产生激发光，导致此类自体荧光现象所产生的背景光会降低荧光探针或抗体信号和背景荧光的比率，从而 导致荧光讯号的解析度和品质的不良，会影响讯号计数与判读。 

发明内容

先前荧光原位杂交法检体前处理步骤是用胃蛋白酶来打断蛋白质的胜肽键，但胃蛋白酶不足改善检体自体荧光的现象。 

为改善上述问题，本发明提供一种用于降低荧光原位杂交法中自体荧光干扰的检体前处理方法，包括以下步骤： 

步骤一：福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织； 

步骤二：切片及烘片； 

步骤三：硫氰酸钠(NaSCN)作用； 

步骤四：在面积24×32mm的组织加入20μl浓度5-10mg/mL第四型胶原蛋白酶或1mg/mL弹性蛋白酶，封片后于37℃作用0.5-1hr，来降解具自体荧光特性的细胞外基质；及 

步骤五：用胃蛋白酶(pepsin)在37℃作用。 

又本发明另提供两种用于降低荧光原位杂交法中自体荧光干扰的检体前处理方法的试剂套组，其一取自纯度100％的溶组织梭菌(clostridium histolyticum)所产生的第四型胶原蛋白酶(collagenase type IV)100mg溶于10mL的磷酸缓冲液(PBS，phosphate buffered saline)后，以浓度10mg/mL在-20℃的温度下储存；另一取自猪胰腺(PORCINE PANCREAS)(≥4.0 units/mg protein)中的第一型胰弹性蛋白酶(ELASTASE PANCREATIC TYPE I)4mg溶于1mL磷酸缓冲液(PBS，phosphate buffered saline)后，以浓度4mg/mL在-20℃的温度下储存。 

本发明在荧光原位杂交法(FISH)的检体前处理步骤增加第四型胶原蛋白酶或弹性蛋白酶处理步骤，来降解具有内源性荧光基团的细胞外基质，可显著降低人类组织自体荧光现象，提高荧光探针信号解析度，提升荧光原位杂交法的检验品质与正确性。 

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。 

附图说明

图1：本发明的步骤流程图。 

图2(A)：通过荧光显微镜显示未使用本发明方法处理的检体空白片照片，可见其具强自体荧光。 

图2(B)：通过荧光显微镜显示使用本发明方法处理后的检体空白片照片，可见其自体荧光下降。 

图3(A)：通过荧光显微镜显示具自体荧光样本经胃蛋白酶前处理后，进行 HER2/CEP17的荧光原位杂交法的照片，可见背景荧光遮蔽FISH探针讯号。 

图3(B)：通过荧光显微镜显示具自体荧光样本使用本发明方法处理后，进行HER2/CEP17的荧光原位杂交法的照片，可见检体自体荧光下降。 

图4(A)：通过荧光显微镜显示具自体荧光样本经胃蛋白酶前处理后，进行HER2/CEP17的荧光原位杂交法扣除背景后的照片，可见探针讯号不清，无法计数。 

图4(B)：通过荧光显微镜显示具自体荧光样本使用本发明方法处理后，进行HER2/CEP17的荧光原位杂交法扣除背景后的照片，可见探针讯号清晰可计数。 

图5(A)：通过荧光显微镜显示未使用本发明方法处理的另一检体空白片照片，可见其具强自体荧光。 

图5(B)：通过荧光显微镜显示使用本发明方法处理后的另一检体空白片照片，可见其自体荧光下降。 

图6(A)：通过荧光显微镜显示具自体荧光样本经胃蛋白酶前处理后，进行EML4/ALK的荧光原位杂交法扣除背景后的照片，可见探针讯号不清，无法计数。 

图6(B)：通过荧光显微镜显示具自体荧光样本使用本发明方法处理后，进行EML4/ALK的荧光原位杂交法扣除背景后的照片，可见探针讯号清晰可计数。 

具体实施方式

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 

参阅图1所示，本发明提供一种用于降低荧光原位杂交法中自体荧光干扰的检体前处理方法，包含以下步骤： 

步骤一(S1)：福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织； 

步骤二(S2)：切片及烘片； 

步骤三(S3)：硫氰酸钠(NaSCN)作用； 

步骤四(S4)：在面积24×32mm经上述处理的组织切片上加入20μl浓度5-10mg/mL第四型胶原蛋白酶或1mg/mL弹性蛋白酶，封片后于37℃作用0.5-1hr，来降解具有自体荧光特性的细胞外基质；及 

步骤五(S5)：用胃蛋白酶(pepsin)在37℃作用。 

在上述检体的前处理方法中，所述步骤一(S1)中，所述组织为乳癌、肺癌组织、皮肤组织、肾脏组织等各种组织，用福尔马林固定石蜡包埋组织的具体方法为：组织在质量浓度为10％中性福尔马林缓冲液(10％ neutral buffered formalin)中浸泡固定，固定时间最少为6小时，最多不超过48小时，再经过酒精脱水(先使用酒精浓度95wt％ 反应3小时后，再使用酒精浓度99.8wt％反应3小时)后，再浸泡二甲苯(Xylene)2小时使其透明化，最后使用石蜡(Paraffin)包埋(时间约3小时)。 

所述步骤二(S2)中，切片的具体方法为：将蜡块置于组织切片机的刀座上夹住蜡块，用组织切片机切取4μm至冷水中，用玻片捞取切片移至50℃水浴中使组织切片摊平，组织切片摊平之后再次用玻片将切片捞起使切片贴附于玻片，再将玻片直立使切片残余之水分顺势流下，剩余之水分用手将其用力甩出；烘片的具体方法是将切片置于烘箱56℃，烘至少2小时以上或隔夜。 

所述步骤三(S3)中，是将烘烤后的切片放入浓度为1M的硫氰酸钠(NaSCN)溶液中，在80℃加热15-25min。用硫氰酸钠(NaSCN)处理的目的是可协助解开福尔马林固定所造成之去氧核醣核酸(DNA)或蛋白质交互缠绕。 

所述步骤五(S5)中，胃蛋白酶(pepsin)的质量浓度为0.005％，步骤四后将其加入到组织切片上，在37℃下放置3-10分钟的时间。用胃蛋白酶(pepsin)处理的目的是用来打断蛋白质的胜肽键结，降解蛋白质，降低完整蛋白所产生自体荧光的现象，并使荧光探针更易与染色体结合。 

本发明以适当比例的第四型胶原蛋白酶(collagenase type IV)以及弹性蛋白酶(elastase)前处理各种蜡块组织，能够降解具有内源性荧光基团的细胞外基质，可显著降低人类组织自体荧光现象，减少荧光检测类的背景讯号，提高荧光探针信号解析度，提升荧光原位杂交法检验品质与正确性。请参阅图2(A)所示，图2(A)通过荧光显微镜以异硫氰酸荧光素滤镜(spectra green FITC filter)观察，未经第四型胶原蛋白酶(collagenase type IV)或弹性蛋白酶(elastase)处理的检体的边缘呈现的亮白边为荧光的部分，显示检体空白片具强自体荧光；通过本发明的检体前处理法处理后，由图2(B)可见检体边缘荧光的部分已呈现灰色，表示检体空白片自体荧光下降。图3(A)显示具自体荧光样本未经第四型胶原蛋白酶(collagenase type IV)或弹性蛋白酶(elastase)处理而仅经过胃蛋白酶(pepsin)前处理后，进行人类表皮生长因子受体-2及染色体17着丝点(HER2/CEP17)的荧光原位杂交法，于荧光显微镜下显示，原始讯号图具强烈背景，图中的灰团表示背景荧光已遮蔽荧光原位杂交法探针讯号；而图3(B)显示经过本发明的检体前处理法处理后，检体自体荧光下降，图中的灰团明显减少，表示背景荧光显著降低，图中的白色点清晰可见，可提供计算讯号点数，代表荧光原位杂交法探针讯号解析度和可计数讯号点数均有显著增加。另请参阅图4(A)，在具有自体荧光样本未经第四型胶原蛋白酶(collagenase type IV)或弹性蛋白酶(elastase)处理而仅经过胃蛋白酶(pepsin)前处理后，进行人类表皮生长因子受体-2及染色体17着丝点(HER2/CEP17)荧光原位杂交法，于荧光显微镜观察下，扣除背景后探针讯号不清，无法计数；而图4(B)显示经过本发明的检体前处理法处理后，检体 自体荧光下降，背景荧光显著降低，荧光原位杂交法探针讯号解析度和可计数讯号点数均有显著增加，图中的白色点清晰可见，可提供计算讯号点数，代表扣除背景后探针讯号清晰可计数。请参阅图5(A)所示，通过于荧光显微镜以异硫氰酸荧光素滤镜(FITC filter)观察，未经第四型胶原蛋白酶(collagenase type IV)或弹性蛋白酶(elastase)处理的检体的边缘呈现的亮白边为荧光的部分，检体空白片具有强自体荧光；通过本发明的检体前处理法处理后，由图5(B)可见检体边缘的荧光的部分已呈现灰色，表示显示检体空白片自体荧光下降。又图6(A)表示具有自体荧光样本未经第四型胶原蛋白酶(collagenase type IV)或弹性蛋白酶(elastase)处理而仅经胃蛋白酶(pepsin)前处理后，进行棘皮动物微管结合蛋白4与间变性淋巴瘤激酶(EML4-ALK)荧光原位杂交法，于荧光显微镜观察，原始讯号图具强烈背景图中的灰团表示背景荧光已遮蔽荧光原位杂交法探针讯号，扣除背景后探针讯号不清，无法计数；图6(B)表示通过本发明的检体前处理法处理后，检体自体荧光下降，图中的灰团明显减少，表示背景荧光显著降低，图中的白色点清晰可见，可提供计算讯号点数，代表背景荧光显著降低，荧光原位杂交法探针讯号解析度和可计数讯号点数均有显著增加，扣除背景后探针讯号清晰可计数。 

又本发明亦提供可用于上述的降低荧光原位杂交法中自体荧光干扰的检体前处理法的两种试剂套组，其一取由纯度100％的溶组织梭菌(clostridium histolyticum)所产生的第四型胶原蛋白酶(collagenase type IV)100mg溶于10mL的磷酸缓冲液(PBS，phosphate buffered saline)后，以浓度10mg/mL在-20℃的温度下储存；另一试剂系取自猪胰腺(PORCINE PANCREAS)(≥4.0 units/mg protein)中的第一型胰弹性蛋白酶(ELASTASE PANCREATIC TYPE I)4mg溶于1mL磷酸缓冲液(PBS，phosphate buffered saline)后，以浓度4mg/mL在-20℃的温度下储存。将此种试剂用于检体前处理亦可改良目前荧光原位杂交法检验试剂套组的限制与缺点，达到与上述前处理方法相同的功效，因此本发明可应用在任何带有自体荧光现象的检体种类(如乳癌、肺癌、皮肤、肾脏等检体)。 

本发明的试剂可根据不同的检体来调配适当的浓度及作用时间，例如使用在乳腺组织检体前处理时，可将上述的第四型胶原蛋白酶试剂在作用浓度5-10mg/mL、作用温度37℃，并于30-60分钟下作用；或使用在肺组织检体前处理时，可将上述的弹性蛋白酶试剂在作用浓度1mg/mL、作用温度37℃，并于30-60分钟下作用。 

综上所述，本发明可改善现有荧光原位杂交法中用胃蛋白酶进行检体前处理步骤导致无法降低检体自体荧光现象的问题，根据平行实验结果验证，具有强自体荧光的检体，经本发明方法处理后检体自体荧光显著大幅下降，比较胃蛋白酶处理方法，经本发明处理后检体探针讯号可清楚计数，探针讯号解析度大幅显著提升。