橙皮油素在制备抑制肠道病毒71型感染药物中的应用

摘要

本发明公开了橙皮油素在制备抑制肠道病毒71型感染药物中的应用，属于生物制药领域。本发明以带有GFP荧光蛋白报告基因的EV71病毒为筛选平台，选取可作为中草药的植物天然产物单分子作为分析对象，发现了一个可以明显抑制EV71感染的中草药成分——橙皮油素，其对EV71感染的抑制效果比已知的EV71病毒感染细胞抑制剂的效果更好，毒性更低，且对其他几种手足口病病原如柯萨奇病毒CA5、CA6、CA10、CA16等有明显的抑制作用，可以作为EV71病毒感染细胞的候选药物。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明涉及橙皮油素在制备抑制肠 道病毒71型感染药物中的应用。

背景技术

肠道病毒71型（EV71）属于小RNA病毒科（Picornaradae）肠道病毒属的 成员，归属于人类肠道病毒A，和柯萨奇病毒A16（Coxsckie A16，CA16）是 手足口病的主要病原，已在世界范围内引起多次暴发与流行，主要发病者为婴 幼儿，严重危害儿童健康，柯萨奇病毒引起的症状轻微，而EV71可感染中枢神 经系统细胞，导致多种如无菌性脑膜炎、脑炎和脊髓灰质炎样的麻痹性疾病等 与神经系统相关的疾病，易发生死亡，成为脊髓灰质炎病毒后第二个易致神经 性疾病的肠道病毒。

近年来，EV71的流行在亚太地区呈上升趋势，然而，手足口病的相关科研 工作比较薄弱，对EV71的关注很少，至今在临床上还没有有效的疫苗和药物对 EV71进行有效的预防和控制。

目前，针对手足口病，尤其是EV71重症的临床治疗上，还缺乏特异、高 效的药物。对EV71感染的重症患儿的治疗主要通过缓解并发症的方法，用呼吸 机维持心肺正常功能，药物控制炎症和水肿等。一些广谱的抗病毒药物，例如 阿昔洛韦、利巴韦林等在手足口病的临床实验中作用微弱。之前的研究报道， 一些化学小分子处在体外实验阶段，并且没有临床用药基础，在有效性和安全 性上都需要进一步优化和测试，因此离临床测试和应用还有很长的距离。

故此，面对EV71的频繁爆发，开发能够快速应用于临床的药物迫在眉睫。

发明内容

基于此，本发明为了克服上述现有技术的缺陷，提供了肠道病毒71型感染 的一种新的抑制剂。

为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

橙皮油素在制备抑制肠道病毒71型感染药物中的应用。

在其中一个实施例中，所述橙皮油素在抑制肠道病毒71型感染药物中的浓 度>0.3微克/毫升。

在其中一个实施例中，所述橙皮油素在抑制肠道病毒71型感染药物中的浓 度>0.55微克/毫升。

本发明还提供了一种抑制肠道病毒71型感染的药物。

为实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种抑制肠道病毒71型感染的药物，所述药物由作为活性成分的橙皮油素 和药学上可接受的辅料组成。

在其中一个实施例中，所述橙皮油素在所述药物中的浓度>0.3微克/毫升。

在其中一个实施例中，所述橙皮油素在所述药物中的浓度>0.55微克/毫升。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以带有GFP荧光蛋白报告基因的EV71病毒(GFP-EV71)为筛选平台， 选取可作为中草药的植物天然产物单分子作为分析对象，发现了一个可以明显 抑制EV71感染的中草药成分—橙皮油素，其对EV71感染的抑制效果比已知的 EV71病毒感染细胞抑制剂的效果更好，毒性更低，且对其他几种手足口病病原 如柯萨奇病毒CA5、CA6、CA10、CA16等有明显的抑制作用，可以作为EV71 病毒感染细胞的候选药物。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同浓度的橙皮油素对病毒感染细胞的抑制曲线 图；

图2为本发明实施例2中不同浓度的橙皮油素对病毒感染细胞的细胞毒性 图；

图3为本发明实施例3中橙皮油素对EV71-GFP感染人神经母细胞瘤细胞 系SK-N-SH和人脑胶质瘤细胞U251的抑制作用图；其中，橙皮油素的添加浓 度为2微克/毫升；

图4为本发明实施例4中橙皮油素在不同时间段对病毒感染细胞的抑制曲 线图；

图5为本发明实施例5中橙皮油素对几种手足口病病原柯萨奇病毒CA5、 CA6、CA10、CA16的抑制作用图，其中，VSV病毒为对照病毒。

具体实施方式

在以下实施例中，所使用的带有GFP荧光蛋白报告基因的EV71病毒 (GFP-EV71)的制备方法请参阅专利申请号为201310134412.X，发明名称为肠道 病毒71型感染荧光报告体系及其构建方法。

以下实施例仅用于说明本发明，但不用来限制本发明的包含范围。若未特 别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用 原料均为市售商品。

实施例1抑制EV71病毒感染细胞的药物小分子的筛选

以带有GFP荧光蛋白报告基因的EV71病毒感染人横纹肌肉瘤细胞系 RD-A细胞为报告体系，来测定502种天然中草药单分子库的药物小分子(中科 院上海生化与细胞所化学生物学技术平台提供)对病毒感染细胞的抑制作用。药 物小分子均是以DMSO进行配制的。

1、初筛

在96孔板中进行药物小分子抑制实验。10⁴/孔人横纹肌肉瘤细胞系RD-A 细胞传至96孔板24小时后，将终浓度为2ug/ml的药物小分子和40TCID₅₀/孔荧 光报告病毒混合后同时加入靶细胞孔内，18小时后通过荧光分析仪（PerkinElmer  VictorX5）检测荧光强度，同体积DMSO加荧光报告病毒混合液的孔作为阴性 对照，不加病毒孔作为阳性对照。初筛结果显示，从502种天然中草药单分子 库的药物小分子中发现橙皮油素对于EV71感染的RD-A细胞有着明显的抑制作 用。橙皮油素与药学上可接受的辅料可以制备抑制EV71病毒感染细胞的候选药 物。

2、复筛

对初筛获得有明显抑制作用，并且镜检无细胞病变或死亡的药物小分子橙 皮油素进行梯度浓度稀释的抑制实验，橙皮油素倍比稀释（0.0625、0.125、0.25、 0.5、1、2、4ug/ml）后与荧光报告病毒混合后加到96孔板靶细胞上，同体积 DMSO加荧光报告病毒的靶细胞孔为阴性对照，同体积DMSO不加病毒组为阳 性对照，18小时后通过荧光分析仪（PerkinElmer VictorX5）检测荧光强度，三 个重复孔实验，绘制抑制曲线，确定橙皮油素的半有效浓度IC50。

以EV71-GFP为工具，以已报道的病毒感染细胞抑制剂——小分子石蒜碱 为阳性对照，药物小分子的配制溶液DMSO为阴性对照，分析了橙皮油素对病 毒感染细胞的抑制曲线，结果如图1所示。

从图1可知，石蒜碱的半有效浓度IC50为0.7微克/毫升，而橙皮油素的半 有效浓度IC50为0.55微克/毫升，橙皮油素对病毒感染细胞的抑制效果比已知 的病毒感染细胞抑制剂的效果更好。

实施例2橙皮油素的细胞毒性

MTT法检测实施例1筛选获得的EV71病毒感染细胞的候选药物橙皮油素 的毒性。

10⁴/孔RD-A细胞传至96孔板24小时后，加入梯度浓度(80，40，20，10， 5，2.5，1.25，0.625，0.3125，0.15625，0.078125微克/毫升)橙皮油素与培养基 （DMEM+10%FBS）的混合液，培养24小时后加入2mg/ml的MTT液（50ul/ 孔），继续培养3小时，吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150ul/孔），将培 养板置于微孔板振荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解，酶标仪检测各孔OD值 （检测波长490nm），记录结果，绘制细胞生长曲线，确定橙皮油素针对RD-A 细胞的半毒性浓度CC50。

以石蒜碱为阳性对照，药物小分子的配制溶液DMSO为阴性对照，通过 MTT细胞活性实验检测橙皮油素对RA-D细胞的细胞毒性，如图2所示。

由图2可知，石蒜碱对RA-D细胞的半毒性浓度CC50为2微克/毫升，橙 皮油素对RA-D细胞的半毒性浓度CC50为30微克/毫升，橙皮油素比石蒜碱对 细胞的毒性更低。

实施例3橙皮油素对EV71-GFP感染神经细胞的抑制作用

将带有荧光蛋白的EV71病毒(EV71-GFP)与2ug/ml橙皮油素同时加入人神 经细胞系SK-N-SH细胞和U251细胞，以未加药物橙皮油素、加病毒为对照， 在荧光显微镜下观察，结果如图3所示。

从图3可以观察到橙皮油素对EV71-GFP感染人神经母细胞瘤细胞系 SK-N-SH和人脑胶质瘤细胞U251均具有明显的抑制作用。

实施例4橙皮油素对EV71感染细胞的抑制时间

将10⁴/孔RD-A细胞传至96孔板24小时后,加入40TCID₅₀/孔的病毒 (EV71-GFP)，孵育梯度时间（15-180分钟），将橙皮油素(2ug/ml)加入到病毒与 细胞的混合物中，37℃培养16小时后，通过荧光分析仪（PerkinElmer VictorX5） 检测荧光强度，三个重复孔实验，绘制抑制曲线。

牛乳铁蛋白（lactoferrin）是已被报道可以明显抑制EV71与细胞粘附的成 分，以此蛋白为阳性对照，通过梯度时间实验，绘制抑制曲线，结果如图4所 示，可以发现：与阳性对照牛乳铁蛋白一样，橙皮油素的抑制作用也发生在病 毒感染早期。

实施例5橙皮油素对其他几种手足口病病原的抑制作用

将10⁴/孔RD-A细胞传至96孔板24小时后，将40TCID₅₀/孔的柯萨奇病毒 CA5，CA6，CA10，CA16(毒株保藏于深圳市疾病预防控制中心，本领域技术 人员可以购买得到)与2ug/ml橙皮油素同时加入人横纹肌肉瘤细胞系RD-A细 胞，阴性对照为仅加入同橙皮油素体积相等的DMSO的细胞与病毒的培养物， 对照病毒为水泡性口炎病毒(VSV病毒)，16小时后显微镜观察病变，结果如图5 所示。

从图5可知，橙皮油素对水泡性口炎病毒(VSV病毒)没有任何抑制作用，对 多种柯萨奇病毒如CA5、CA6、CA10、CA16均有明显的抑制作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。