一株过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一株过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌及其构建方法与应用，克隆了嘌呤补救合成途径的关键酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt），利用大肠杆菌-节杆菌穿梭质粒构建重组表达质粒。通过电转化的方法，将重组质粒导入节杆菌，通过卡那霉素抗性筛选转化子，然后通过质粒PCR对基因工程菌进行验证，从而构建了重组节杆菌AR-HG。本发明构建的重组节杆菌AR-HG比出发菌株的产量提高16.6%，单位菌体cAMP合成能力提高27.0%，可直接用于cAMP的工业化生产，提高产量降低成本。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和微生物发酵技术领域，具体涉及一种过表达次黄嘌呤磷酸核 糖转移酶基因的节杆菌及其构建方法与应用。

背景技术

环磷酸腺苷（cyclic adenosine-3’,5’-monophosphate，简称cAMP），是一种具有细胞 内信息传递作用的小分子，被称为第二信使，在生物体内广泛存在，对糖代谢、脂肪代 谢、核酸合成、蛋白质合成以及细胞分化、癌变、逆转等多种生理生化过程发挥着重要 的调控作用。在临床上，cAMP可用于治疗心血管疾病、甲亢、慢性肾功能不全、神经 系统疾病、肝胆疾病和呼吸系统疾病等。作为动物饲料添加剂，cAMP既具有拟生长激 素的作用，能够促进动物生长，提高乳畜产奶量、肉畜增重率和绵羊产毛量。作为医药 中间体，cAMP能派生出一系列重要的衍生物，如环磷酸腺苷葡甲胺和二丁酰环磷酸腺 苷，用于治疗心脑血管疾病和恶性肿瘤等。cAMP作为一种典型的精细化学品，具有重 要的应用价值和广阔的市场前景，因此受到广泛关注。

化学合成法是目前国内外产业化生产cAMP的主要方法，但是存在收率低、环境污 染严重、生产成本高等严重缺陷；而酶法又存在酶稳定性差、底物昂贵等问题，因此， 急需开发条件温和、成本廉价、环境友好的新工艺来进行替代。

目前，国内外对于发酵法生产cAMP菌株的改造主要是通过传统诱变的方式筛选底 物耐受性菌株，或是肌苷酸脱氢酶缺失型菌株，尚未有通过分子生物学技术改造菌株来 提高cAMP产量。因此通过基因工程技术构建高产优良菌株，进一步提高cAMP产量， 具有重要的经济价值和社会意义。

发明内容

本发明提所要解决的技术问题是提供一株过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因 （hgprt基因）的节杆菌，通过过表达hgprt基因提高cAMP的产量。

本发明还要解决的技术问题是提供上述节杆菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题是提供上述节杆菌的应用。

hgprt基因是编码次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因，次黄嘌呤磷酸核糖转移酶是嘌呤 补救合成途径的关键酶。而嘌呤补救合成途径是生产cAMP的主要途径，基于以上理论 分析，过表达hgprt基因，能够增大补救合成途径的代谢流量，有利于提高cAMP产量， 降低成本。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一株过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌，它是利用PCR扩增克隆嘌呤 补救合成途径的关键酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hgprt，将上述基因片段连接到过 表达载体，然后利用电转化的方法转化节杆菌，通过抗生素抗性筛选获得目的基因的工 程菌。

其中，所述的表达载体为游离质粒载体。优选的，所述的表达载体为pARK。所述 表达载体中的组成型启动子为hndO。

上述过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌的构建方法，该方法包括如下步 骤：

（1）设计PCR引物扩增次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hgprt；

（2）将克隆得到的目的基因插入pARK的组成型启动子hndO下游多克隆位点， 得到pARK-HG过表达质粒；

（3）然后将pARK-HG过表达质粒导入大肠杆菌DH5a中，以备扩增后电转化；

（4）将经提取、浓缩后的pARK-HG过表达质粒电转化节杆菌，30℃复苏8小时 候，涂布卡那霉素抗性平板，再在30℃培养36小时，筛选转化子；

（5）转化子经质粒提取后，利用PCR进行验证，从而获得过表达次黄嘌呤磷酸核 糖转移酶基因hgprt的节杆菌重组菌AR-HG。

上述过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因的节杆菌在制备cAMP中的应用。

具体制备方法包括如下步骤：

（1）将节杆菌重组菌AR-HG单菌落划线至斜面种子培养基，30℃培养48-72小时；

（2）刮一环菌体接种到装有50mL液体种子培养基的500mL摇瓶中，30℃， 200-250rpm摇床中培养24小时，制备种子液；

（3）以10(v/v)%的接种量，接种到发酵培养基中，25-35℃、pH7.0-7.2、通风量4-12 L/min、搅拌转速250-350rpm条件下，发酵48-96小时；优选在30℃、pH7.0-7.2、通风 量8L/min、搅拌转速350rpm条件下，发酵72小时。

其中，所述的种子培养基组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10g/L， 牛肉膏10g/L，pH7.2；所述的斜面种子培养基为种子培养基中加入琼脂2wt%。

其中，所述的发酵培养基组成为：葡萄糖40g/L，K₂HPO₄18g/L，KH₂PO₄5g/L， MgSO₄·7H₂O0.1g/L，尿素10g/L，CoCl₂0.005g/L，NaF0.4g/L，生物素0.01g/L，次 黄嘌呤6g/L，pH7.0。

有益效果：本发明提供了能提高cAMP产量的基因工程菌的构建方法。该方法包括 以下过程：克隆嘌呤补救合成途径的关键酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hgprt，利用 大肠杆菌-节杆菌穿梭质粒构建重组质粒（如图1）。通过电转化的方法，将重组质粒导 入节杆菌，通过卡那霉素抗性筛选转化子，然后通过质粒PCR对基因工程菌进行验证 （如图2），从而构建了重组节杆菌AR-HG。本发明构建的重组节杆菌AR-HG比出发 菌株的产量提高16.6%，单位菌体cAMP合成能力提高27.0%，可直接用于cAMP的工 业化生产，提高产量降低成本。

附图说明

图1过表达重组载体构建流程。

图2AR-HG重组节杆菌质粒PCR验证（M：DL5000marker；1：扩增pCGori复制 原点；2：扩增kan基因；3：扩增hgprt基因）。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的 本发明。

实施例1：基因工程菌AR-HG的构建。

设计引物PCR扩增hgprt。

上下游引物分别为：

上游引物：AACTGCAGgTTGGTGGATTCAAACGAC（下划线为PstI酶切位点）；

下游引物：GCGTCGACCTACTCGTAAACGTGCGG（下划线为SalI酶切位点）。

将PCR产物和表达载体pARK分别用PstI和SalI双酶切，回收后，将hgprt和pARK 以3:1～5:1的比例用T4连接酶在16℃连接3小时构建重组表达载体pARK-HG（如图1）。 然后将pARK-HG过表达质粒经提取、浓缩后，电转化节杆菌，30℃复苏8小时候，涂 布卡那霉素抗性平板，再在30℃培养36小时，筛选转化子。转化子经质粒提取后，利 用PCR进行验证（如图2），从而获得过表达次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因hgprt的节 杆菌重组菌AR-HG。

电转化具体步骤如下：

节杆菌感受态制备：

（1）LB平板活化，挑单菌落至5mL LB液体培养基，30℃培养24h；

（2）转接0.1%至100mL LB液体培养基，30℃培养约18h，至OD₆₀₀接近0.6；

（3）加青霉素G钠盐至终浓度为30μg/mL，继续培养1h；

（4）4000×g，4℃离心10min，收集菌体，用30mL10%甘油+0.5mol/L山梨醇洗；

（5）重复洗3遍；

（6）用1mL10%甘油+0.5mol/L山梨醇重悬，分装成10管，-80℃保存。

节杆菌电转：

（1）质粒提取后用异丙醇沉淀浓缩，终浓度至500ng/μL左右；

（2）取2μL质粒加入100μL感受态细胞，轻轻混匀，加入预冷的0.2mm电击杯；

（3）2.5kV，25μF，400Ω，电击；

（4）立即加入含0.5mol/L山梨醇的900μL LB培养基，30℃复苏8h；

（5）稀释适当倍数后涂卡那150μg/mL平板，36h可看到明显菌落。

实施例2：节杆菌重组菌AR-HG的发酵应用。

将节杆菌重组菌AR-HG单菌落划线至斜面种子培养基，30℃培养48-72小时；刮 一环菌体接种到装有50mL液体种子培养基的500mL摇瓶中，30℃，200-250rpm摇床 中培养24小时，制备种子液；以10(v/v)%的接种量，接种到装液量为3L的5L自动控 制发酵罐中，在发酵培养中30℃培养，控制pH7.0-7.2，通风量8L/min，搅拌转速350rpm， 发酵72小时。通过HPLC检测发酵液中的cAMP浓度。重组节杆菌AR-HG比出发菌 株的产量提高16.6%，为6.04g/L；单位菌体cAMP合成能力提高27.0%，为0.606g cAMP/ 每克菌体。