利用Red同源重组系统构建兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因打靶载体

摘要

利用EL350基因工程菌进行同源重组,成功进行基因敲除已有报道,但利用该系统进行兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因突变和基因打靶方面的研究还没有报道。实验首先在已经筛选到含有兔全长HPRT基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,通过Gap-Repair方式从此克隆上将一段47kb无启动子的HPRT基因组片段(不含有第1个外显子)克隆到pBACLinkSp质粒上,产生pBACLinkSp-rHPRT质粒。然后基于pBACLinkSp-rHPRT质粒,设计不同的同源臂,从而删除了HPRT基因的不同编码区,成功构建了三个不同的HPRT基因打靶载体。同时对利用同源重组技术敲除不同大小的DNA片段的效率进行了研究。基于实验所构建的三个不同的兔HPRT基因打靶载体,为探索兔成纤维细胞和胚胎干细胞基因打靶的适宜条件,及进一步获得兔HPRT基因敲除动物疾病模型奠定了基础。