重组表达载体pEGFP-DsRed-BP及其在检测哺乳动物细胞内ΦC31整合酶活性中的应用

摘要

本发明属于生物工程和蛋白活性检测技术领域，公开了一种重组表达载体pEGFP-DsRed-BP及其制备方法，该表达载体包含载体骨架pEGFP-C1、反向互补插入的DsRed基因序列、φC31整合酶识别序列attB以及反向互补插入的attP序列。本发明还公开了采用该表达载体检测哺乳动物细胞内φC31整合酶活性的方法，其根据共转染后细胞发出的荧光类型或不同荧光细胞间的比例来定性或定量检测φC31整合酶在哺乳动物细胞中的活性。该方法只需一次转染便能通过荧光蛋白直观地评价φC31整合酶在哺乳动物细胞中的活性，检测方法简便，结果可靠且检测成本较低。

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程和蛋白活性检测技术领域，具体涉及重组表达载体 pEGFP-DsRed-BP及其在检测哺乳动物细胞内φC31整合酶活性中的应用。

背景技术

来源于链霉菌噬菌体的φC31整合酶能够特异性地催化噬菌体基因组与宿 主基因组之间的重组反应。在该重组反应中，φC31整合酶能够识别并介导attB （最小34bp）和attP（最小39bp）DNA片段之间的重组（Groth A C,Olivares E  C,Thyagarajan B,et al.A phage integrase directs efficient site-specific integration in  human cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,11:5995-6000），重组后产生杂合的 attL和attR，而这两个新杂合位点不能被φC31整合酶再次识别，因此该重组 反应具有单向性的特点。不仅如此，该重组反应还不需要任何能量和辅助因子， 因此，φC31整合酶已经成为目前的一种有力的基因修饰工具，在基因治疗和 转基因动物生产中均具有很大的应用价值。

然而，该整合酶系统目前还存在一些缺陷和不足，如该酶的作用效率和特 异性是细胞类型特异的，在某些细胞类型中，其作用效率非常低。目前一些研 究人员正试图筛选出一些活性更高的整合酶突变体。因此如何设计一种简便并 且在各种细胞内均能有效检测φC31整合酶活性的方法，对促进该酶在不同细 胞类型中的应用以及筛选整合酶活性更高的突变体都具有重要的意义。

在目前的细胞内φC31整合酶活性检测方法中，其检测指标主要是依据表 达GFP细胞的比例以及荧光素酶或者β-半乳糖苷酶的表达量等来检测酶的活 性(Keravala A,Lee S,Thyagarajan B,et al.Mutational derivatives of phiC31 integrase with increased efficiency and specificity.The American Society of Gene  Therapy,2009,1:112-120.Maucksch C,Aneja M K,Hennen E,et al.Cell type  differences in activity of the Streptomyces bacteriophageφC31integrase.Nucleic  Acids Research,2008,17:5462-5471)。但前者的检测指标很容易受到转染效率的 影响，后者的检测指标均需要专业而且价格昂贵的试剂检测盒才能释放荧光信 号，检测成本较高。

发明内容

针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明一方面提供了一种重组表达载体 pEGFP-DsRed-BP，其包含载体骨架pEGFP-C1、反向互补插入的DsRed基因序 列、φC31整合酶识别序列attB以及反向互补插入的attP序列。

在一个优选的实施方案中，上述重组表达载体pEGFP-DsRed-BP是通过以 下步骤制备而来的：

1、依据φC31整合酶特异性催化DNA重组反应的机制和特点，分别合成 能够被该酶识别的attB序列和attP反向互补序列。

2、从pDsRed-monomer-N1载体中克隆全长的DsRed-monomer基因（包含 完整Kozak序列）。

3、以pEGFP-C1载体为骨架，将attB序列插入到其中的Nhe Ⅰ和Age Ⅰ两 酶切位点之间，将attP反向互补序列插入到Pst Ⅰ和BamH Ⅰ两酶切位点之间， 将DsRed-monomer基因的反向互补序列插入到Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ两酶切位点之 间，构建成pEGFP-DsRed-BP载体。

本发明另一方面提供了一种制备重组表达载体pEGFP-DsRed-BP的方法， 其包括如下步骤：

1、依据φC31整合酶特异性催化DNA重组反应的机制和特点，分别合成 能够被该酶识别的attB序列和attP反向互补序列。

2、从pDsRed-monomer-N1载体中克隆全长的DsRed-monomer基因（包含 完整Kozak序列）。

3、以pEGFP-C1载体为骨架，将attB序列插入到其中的Nhe Ⅰ和Age Ⅰ两酶 切位点之间，将attP反向互补序列插入到Pst Ⅰ和BamH Ⅰ两酶切位点之间，将 DsRed-monomer基因的反向互补序列插入到Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ两酶切位点之间， 构建成pEGFP-DsRed-BP载体。

本发明的再一方面还提供了一种能够简便、有效、低成本地检测哺乳动物 细胞内φC31整合酶活性的方法，其包括如下步骤：

1、按照上述方法制备重组表达载体pEGFP-DsRed-BP。

2、将pCMVInt（表达φC31整合酶）和pEGFP-DsRed-BP共转染哺乳动物 细胞。

3、荧光细胞检测。

4、根据细胞发出的荧光类型或不同荧光细胞间的比例来定性或定量检测φ C31整合酶在哺乳动物细胞中的活性。

在一个优选的实施方案中，本发明的φC31整合酶活性的计算公式为红色单 荧光细胞数/（红色单荧光细胞数+红色绿色双荧光细胞数）。

本发明的最后一方面还提供了上述重组表达载体pEGFP-DsRed-BP在检测 哺乳动物细胞内φC31整合酶活性中的应用。

与现有技术相比，本发明的检测哺乳动物细胞内φC31整合酶活性的方法 具备如下显著的技术效果：

1、该方法实施简单方便，只需要一次转染便能通过荧光报告蛋白直观评价 φC31整合酶在哺乳动物细胞中的作用效率。

2、本发明所选用的荧光蛋白EGFP和DsRed荧光强度大，信噪比高，均 是分子生物学中常用的报告蛋白，两者激发和发射波长均相差较大，能够客观 真实地反应被转染细胞的荧光情况。

3、本发明通过红色单荧光细胞数与红色荧光细胞总数（红色单荧光细胞数 +红色绿色双荧光细胞数）之间的比值很好地排除了转染效率、pCMVInt与 pEGFP-DsRed-BP不均等转染以及转染试剂对细胞的毒性作用等情况对检测结 果的影响。

4、利用本发明的方法可以对φC31整合酶的活性进行定性或定量评价。具 体表现为：

（1）用荧光显微镜对共转染24h后的哺乳动物细胞进行荧光观察，若有红 色荧光出现，则可判定φC31整合酶在该类细胞中可以发挥作用。通过对发绿 光和红光细胞数之间比例的观察可粗略估计φC31整合酶在该细胞类型中的相 对作用效率（活性）。

（2）借助流式细胞术对荧光细胞进行计数，此时荧光细胞可分为三类，绿 色单荧光细胞、红色单荧光细胞以及绿色、红色双荧光细胞，其中通过计算红 色单荧光细胞数占红色荧光细胞总数的比例来确定该种细胞内φC31整合酶的 相对作用效率（活性）。

附图说明

图1为φC31整合酶作用前pEGFP-DsRed-BP结构示意图。

1：启动子序列；

2：attB序列；

3：EGFP基因序列；

4：反向互补插入的DsRed基因序列；

5：反向互补插入的attP序列；

6：polyA结构序列。

图2为φC31整合酶作用后pEGFP-DsRed-BP结构示意图。

1：启动子序列；

2：attL序列；

3：DsRed基因序列；

4：反向互补的EGFP基因序列；

5：反向互补插入的attR序列；

6：polyA结构序列。

图3为本发明实施例中转染后CHO细胞的荧光观察（100×）图。

A：DsRed在CHO细胞中的表达，细胞表达红色荧光蛋白；B：EGFP在 CHO细胞中的表达，细胞表达绿色荧光蛋白。

图4为本发明实施例中转染后HEK293细胞的荧光观察（100×）图。

A：DsRed在HEK293细胞中的表达，细胞表达红色荧光蛋白；B：EGFP 在HEK293细胞中的表达，细胞表达绿色荧光蛋白。

图5为本发明实施例中转染后BHK细胞的荧光观察（100×）。

A：DsRed在BHK细胞中的表达，细胞表达红色荧光蛋白；B：EGFP在 BHK细胞中的表达，细胞表达绿色荧光蛋白。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步详细说明，但不作为对本发明的限定。

实施例1：pEGFP-DsRed-BP载体的构建

根据文献公布的最小attB和attP序列，人工合成包含最小attB的序列和 attP的反向互补序列，attB：CGGTGCGGGTGCCAGGGCGTGCCCTTGGGCTC  CCCGGGCGCGTACTCCACC,attP反向互补序列：GTAGTGCCCCAACTGGGG  TAACCTTTGAGTTCTCTCAGTTGGGGGCGTAG，在attB序列左右两端分别 加上Nhe Ⅰ和Age Ⅰ的酶切位点，在attP反向互补序列的左右两端分别加上 BamH Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点。以pDsRed-monomer-N1载体为模板，设计上游引物 Pred1(EcoR Ⅰ)：GGAATTCCACCGGTCGCCACCAT;下游引物Pred2(Xho Ⅰ)： CCGCTCGAGCGTAGAGTCGCGGCCGCTCT。用上述合成的一对引物，以 pDsRed-monomer-N1载体为模板进行PCR扩增，将扩增所得的DsRed-monomer 基因经测序鉴定后和合成的attB序列、attP反向互补序列一起按照其两端的酶 切位点插入pEGFP-C1载体中，经测序鉴定正确后即为pEGFP-DsRed-BP载体。

实施例2：pCMVInt和pEGFP-DsRed-BP共转染CHO、HEK293和BHK 细胞

将CHO、HEK293和BHK细胞接种于六孔细胞培养板中，待细胞汇合度 达到50%时，用100μl无血清培养液稀释3μg的质粒（1.5μg pCMVInt和1.5μg pEGFP-DsRed-BP）和6μl的转染试剂，混合后放置30min。将6孔板中的培养 液完全吸出，用无血清培养液洗两遍，洗去血清。在质粒和脂质体的混合液中， 加入1.5ml无血清培养液，轻轻混匀，小心滴至6孔板中，于37℃50ml/L CO₂培养箱中温育6h。弃去转染液，加2ml（含100ml/L血清的DMEM）细胞培养 液继续培养。

实施例3：荧光细胞的检测

转染24h后，将上述细胞培养板置于荧光显微镜下观察。结果发现：在CHO、 HEK293和BHK细胞中均有DsRed的表达，参见说明书附图3、4和5。表明 φC31整合酶在这3种细胞中均可发挥作用。将荧光细胞消化，离心收集后， 重悬于PBS缓冲液中进行流式细胞术分析。

实施例4：哺乳动物细胞内φC31整合酶的相对作用效率（活性）分析

在pCMVInt和pEGFP-DsRed-BP共转染的过程中，被转染的细胞可能存在 三种情况：转入pCMVInt的量远多于pEGFP-DsRed-BP，转入pCMVInt的量 远少于pEGFP-DsRed-BP或者转入pCMVInt的量与pEGFP-DsRed-BP相差不 大。只有第三种情况，即转入pCMVInt的量与pEGFP-DsRed-BP相差不大时才 能客观真实反映出φC31整合酶在细胞内的作用效果。此外，转染试剂对细胞 的毒性作用也会干扰φC31整合酶在细胞内发挥作用。因此，在计算整合酶作 用效率时排除了无荧光细胞和绿色单荧光细胞，其计算公式为红色单荧光细胞 数/（红色单荧光细胞数+红色绿色双荧光细胞数）。

计算结果表明：

1、在不同转染效率情况下，用该策略检测出的CHO细胞中φC31整合酶 的作用效率差异不显著（P＞0.05，P为单因素方差），说明该检测方法不受转 染效率的影响，具体结果参见表1。

2、φC31整合酶在HEK293细胞中的作用效率是BHK细胞中的1.6倍， 差异显著（P＜0.05）。

表1.不同转染效率对CHO内φC31整合酶活性检测结

注：转染效率计算公式为荧光细胞数/细胞总数；A组所用的转染试剂为 Lipofectamine2000，共包括四个平行试验；B组所用的转染试剂为Fugen HD， 共包括四个平行试验。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解 本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可 用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上 述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化 不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明的保护范围内。