酵母浓度和存活率的测定

摘要

本发明一般地涉及分析酵母存活率。更具体地，本发明涉及用于获取和测定酵母细胞的存活率和浓度的高效和有效的方法和组合物。

说明书

技术领域

本发明一般地涉及分析酵母存活率。更具体地，本发明涉及用 于获取和测定酵母细胞的存活率和浓度的高效的和有效的方法和组 合物。

背景技术

在过去的二十到三十年间，生物燃料的开发和生产取得了显著 的增长。随着化石燃料的持续消耗和对全球气候变暖的日益关注， 在巴西、美国和许多其他欧洲国家已引入大规模生物燃料生产以促 进可再生能源的更替。目前，最大的生物燃料工艺严重依赖于乙醇 生产，其采用面包酵母、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，对甘 蔗、玉米粉、多糖和废水进行发酵。由于其高乙醇耐受性、最终乙 醇浓度、葡萄糖转化率以及工业发酵的历史可靠性，酵母是用于生 物乙醇生产的理想成分。(Antoni等人，“Biofuel from microbes”， Applied Microbiology Biotechnology，第77卷，第23-35页，2007年； Vertès等人，“Technological Options for Biological Fuel Ethanol”， Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology，第15卷，第 16-30页，2008年；Basso等人，“Yeast selection for fuel ethanol  production in Brazil”FEMS Yeast Research，第8卷，第1155-1163页， 2008年；等人，“Effect of different fermentation parameters on  bioethanol production from corn meal hydrolyzates by free and  immobilized cells of Saccharomyces cerevisiae var.ellipsoideus”， Journal of Chemical Technological Biotechnology，第84卷，第 497-503页，2009年；Gibbons等人，“Integrated biorefineries with  engineered microbes and high-value co-products for profitable biofuels  production”，In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，第45 卷，第218-228页，2009年；Hu等人，“Genetic Dissection of Ethanol  Tolerance in the Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae”，Genetics， 第175卷，第1479-1487页，2007年；Argueso等人，“Genome structure  of a Saccharomyces cerevisiae strain widely used in bioethanol  production”，Genome Research，第19卷，第2258-2270页，2009年； Eksteen等人，“Starch Fermentation by Recombinant Saccharomyces  cerevisiae Strains Expressing the a-Amylase and Glucoamylase Genes  From Lipomyces Kononenkoae and Saccharomycopsis fibuligera”， Biotechnology and Bioengineering，第84卷，第639-646页，2003年。)

在美国，标准的基于酵母的发酵工艺利用从玉米淀粉中提取的 葡萄糖。对玉米(整株植物，包括玉米粒)进行干式研磨处理，并 与α-淀粉酶一起在pH 6下加热至100℃。醪液(mash)与葡糖淀粉 酶一起在pH 4.5下冷却到65℃，以将淀粉降解为葡萄糖，其然后可 能用野生型面包酵母消化。然后将最终的组合物冷却至32℃并转移 到发酵罐中，向其中添加酵母以启动乙醇生产。通常，整个发酵过 程需要约48-72小时，以达到10-12％的最终乙醇浓度。所添加的酵 母的浓度和存活率是获得最大量乙醇产生的关键因素。因此，用于 测定酵母浓度和存活率的方法对于提供一致的乙醇产出是非常重要 的。

有几种用于测定纯酵母样品的浓度和存活率的方法，如使用手 动细胞计数器的光学和荧光显微镜术和流式细胞术。(Trevors等人， “A Comparison of Methods for Assessing Yeast Viability，” Biotechnology Letters，第5卷，第131-134页，1983年；Hernlem等人， “Dual Fluorochrome Flow Cytometric Assessment of Yeast Viability，” Current Microbiology，在线出版，2010年；Chang等人，“Flow  cytometric quantitation of yeast a novel technique for use in animal  model work and in vitro immunologic assays，”Journal of  Immunological Methods，第211卷，第51-63页，1998年；Deere等人， “Flow Cytometry and Cell Sorting for Yeast Viability Assessment and  Cell Selection，”Yeast，第14卷，第147-160页，1998年；Bouchez等人， “Physiological Significance of the Cytometric Distribution of  Fluorescent Yeasts After Viability Staining，”Biotechnology and  Bioengineering，第86卷，第520-530页，2004年；Malacrinó等人， “Rapid detection of viable yeasts and bacteria in wine by flow  cytometry，”Journal of Microbiological Methods，第45卷，第127-134 页，2001年。)手动细胞计数器成本低廉，但繁琐且容易出现人为错 误，从而导致大的不一致性。(Ng等人，“The Challenge to Measure Cell  Proliferation in Two and Three Dimensions，”Tissue Engineering，第11 卷，第182-191页，2005年；Szabo等人，“Evaluation of an Automated  Instrument for Viability and Concentration Measurements of  Cryopreserved Hematopoietic Cells，”Laboratory Hematology，第10卷， 第109-111页，2004年。)与之相比，流式细胞术自动采集数据，但 需要用于浓度测定的校准珠(calibration beads)，和彻底的清洁程序 以防止样品之间的交叉污染。此外，流式细胞术的成本也阻碍了简 单且具成本效益的酵母浓度测定方法的开发。(Davey等人，“Flow  Cytometry and Cell Sorting of Heterogeneous Microbial Populations： the Importance of Single-Cell Analyses，”Microbiological Reviews，第 60卷，第641-696页，1996年；Michelson，“Flow Cytometry：A Clinical  Test of Platelet Function，”Blood，第87卷，第4925-4936页，1996年。)

虽然每种方法都有其缺点，但是荧光检测仍然可以对纯酵母样 品提供相对精确的浓度和存活率的测定。(Henry-Stanley等人， “Adaptation of FUN-1 and Calcofluor white stains to assess the ability  of viable and nonviable yeast to adhere to and be internalized by  cultured mammalian cells，”Journal of Microbiological Methods，第59 卷，第289-292页，2004年；Zandycke等人，“Determination of Yeast  Viability Using Fluorophores，”Journal of American Society of Brewing  Chemists，第61卷，第15-22页，2003年；King等人，“Epifluorescent  Method for Detection of Nonviable Yeast，”Journal of American Society  of Brewing Chemists，第39卷，第52-54页，1981年；McCaig， “Evaluation of the Fluorescent Dye l-Anilino-8-Naphthalene Sulfonic  Acid for Yeast Viability Determination，”Journal of American Society of  Brewing Chemists，第48卷，第22-25页，1990年；Nikolova等人，“An  Optimised Method for Investigation of the Yeast Viability by Means of  Fluorescent Microscopy，”Journal of Culture Collections，第3卷，第 66-71页，2002年；Zhang等人，“Quantification of Saccharomyces  cerevisiae viability using BacLight，”Biotechnology Letters，第26卷， 第989-992页，2004年；Slater，“Rapid Nuclear Staining Method for  Saccharomyces cerevisiae，”Journal of Bacteriology，第126卷，第 1339-1341页，1976年；Oh等人，“Rapid viability assessment of yeast  cells using vital staining with 2-NBDG，a fluorescent derivative of  glucose，”International Journal of Food Microbiology，第76卷，第 47-53页，2002年；Lloyd等人，“Vigour，vitality and viability of  microorganisms，”FEMS Microbiology Letters，第133卷，第1-7页， 1995年；Rodriguez-Porrata等人，“Vitality enhancement of the  rehydrated active dry wine yeast，”International Journal of Food  Microbiology，第126卷，第116-122页，2008年。)

然而，更重要的是在发酵过程中能准确和高效地测定这些参数， 以确保一致的过程。由于杂乱(messy)样品中的残渣会严重干扰使 用细胞计数器、流式细胞术和荧光显微镜术的计数方法的一致性的 事实，以前的出版物的一个共同特点是所有的测试样品均为脱水的 酵母或已经经过纯化。因为玉米醪的残渣会阻止技术人员和流式细 胞仪精确地测定浓度和存活率，上述方法将会造成很大的困难。 (Abbott等人，“Buffering capacity of whole corn mash alters  concentrations of organic acids required to inhibit growth of  Saccharomyces cerevisiae and ethanol production，”Biotechnology  Letters，第26卷，第1313-1316页，2004年；Devantier等人， “Characterization of very high gravity ethanol fermentation of corn  mash.Effect of glucoamylase dosage，pre-saccharification and yeast  strain，”Applied Microbiology and Biotechnology，第68卷，第622-629 页，2005年。)

先前出版的关于AO和PI的文章在其最佳pH 6.5-7.4内使用两 种染料，对于对哺乳动物细胞生物学上可行的缓冲液来说，这是最 常见的pH值。在明视野(bright-field)方案中，手动和自动两种方 法都受到成像视野中的残渣的阻碍，因此一致的测定经常是受限的。 由于溶液中残渣的非特异性染色，使用荧光测量来特异性检测杂乱 样品中的酵母也遇到了问题。此外，荧光检测会导致较弱的靶细胞 信号和大量的玉米醪残渣的非特异性染色。只有通过从玉米醪中分 离酵母的费力的过滤过程，才可以有效地利用上述方法。然而，当 在其发酵环境中测定时，酵母的浓度和存活率能得到更精确地表示。

因此，在杂乱的工业样品测定酵母存活率的需要没有得到满足。 在此呈现的本发明描述了使用标准荧光染色剂和调整缓冲液的pH 值，用于检测和测定酵母的浓度和存活率的新方法。

发明内容

本发明部分基于对用于获得和测定酵母细胞存活率和浓度的高 效和有效的方法和组合物的发现。本发明解决了先前方法的缺点， 因为可以通过本发明的方法容易并精确地分析实时样品，如包含玉 米醪和其他残渣的来自生物燃料植物的样品。因为本发明允许高染 色特异性，杂乱的样品可以得到有效地测定。除了玉米醪，甘蔗发 酵中的酵母存活率也可以使用该方法进行测定。

一方面，本发明一般地涉及用于测定酵母细胞的浓度的方法。 该方法包括：在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用染料对将 要测定酵母细胞浓度的样品进行染色；获取经染料染色的样品的荧 光图像；分析经染料染色的样品的荧光图像，以确定存活酵母细胞 的浓度。

另一方面，本发明一般地涉及用于确定酵母存活率的方法。该 方法包括：在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第一染料和 第二染料对将要测定酵母存活率的样品进行染色；获取经第一染料 染色的样品的荧光图像；获取经第二染料染色的样品的荧光图像； 并比较经第一染料染色的样品的荧光图像和经第二染料染色的样品 的荧光图像以确定酵母存活率。

又一方面，本发明一般地涉及用于测定存活酵母细胞的浓度的 方法。该方法包括：在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第 一染料和第二染料对待测样品进行染色；获取经第一染料染色的样 品的至少一幅静态荧光图像；获取经第二染料染色的样品的至少一 幅静态荧光图像；并分析该经第一染料染色的样品的至少一幅静态 荧光图像和该经第二染料染色的样品的至少一幅静态荧光图像以确 定样品中的存活酵母细胞的浓度。

又一方面，本发明一般地涉及用于测定酵母存活率的方法。该 方法包括：在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第一染料和 第二染料对将要测定酵母存活率的样品进行染色；获取经第一染料 染色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像； 比较该经第一染料染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅荧 光图像以确定样品中活酵母细胞的特征；获取经第二染料染色的样 品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像；并比较该 经第二染料染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅荧光图像 以确定样品中不存活的酵母细胞的特征。该方法可进一步包括确定 存活酵母细胞的浓度。

又一方面，本发明一般地涉及用于测定存活酵母细胞的浓度的 方法。该方法包括：在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第 一染料和第二染料对待测样品进行染色；获取经第一染料染色的样 品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像；获取经第 二染料染色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光 图像；并确定样品中的存活酵母细胞的浓度。

又一方面，本发明一般地涉及用于测定酵母存活率的方法。该 方法包括：在pH为约10.5至约12.5的缓冲液条件下，用吖啶橙对 将要测定酵母存活率的样品进行染色；通过将明视野光束指向样品 获取经吖啶橙染色的样品的至少一幅静态明视野图像；通过将激发 光束指向样品获取经吖啶橙染色的样品的至少一幅静态荧光图像； 比较该经吖啶橙染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅荧光 图像以确定样品中的存活酵母的特征；在约10.5至约12.5的pH的 缓冲液条件下，用碘化丙锭对将要测定酵母存活率的样品进行染色； 通过将明视野光束指向样品获取经碘化丙锭染色的样品的至少一幅 静态明视野图像；通过将激发光束指向样品获取经碘化丙锭染色的 样品的至少一幅静态荧光图像；比较该经碘化丙锭染色的样品的至 少一幅明视野图像和至少一幅荧光图像以确定样品中不存活的酵母 的特征；并确定该样品的酵母存活率。

附图说明

这里给出的附图是一系列严格的荧光成像分析实验，用以发现 用来直接从发酵罐中测定酵母存活率的工作模型，其中荧光试剂并 不在优化条件的正常范围内。

图1显示了在不同浓度下的一系列4种UV激发的染料，其中 比较了酵母的荧光信号。

图2显示了在不同浓度下的2种蓝光激发的染料，其中比较了 酵母的荧光信号。

图3显示了在不同浓度下的2种绿光激发的染料，其中比较了 酵母的荧光信号。

图4显示了对纯酵母样品使用SYTO 9(活的)和碘化丙锭(不 存活的)染色剂的明视野图像(左)、存活酵母(右)和不存活的 酵母(下)的实例。

图5显示了吖啶橙或SYTO 9对玉米醪样品中的酵母的活细胞染 色的荧光图像的实例，其中显示来自玉米醪残渣的大的非特异性荧 光信号。

图6显示了pH 7-pH 9的玉米醪中的酵母的一系列荧光图像，其 中玉米醪仍然显示非特异性信号。

图7显示了pH 10-pH 11.50的玉米醪中的酵母的一系列荧光图 像，其中去除了玉米醪的非特异性信号。

图8显示了在高pH水平下对碘化丙锭的一系列浓度调整，其中 也消除了玉米醪的信号。

图9显示了来自正在运行的发酵罐的真实发酵酵母样品的2个 实例，其中使用所发现的荧光检测方法来清楚地区分玉米醪中存活 的和不存活的酵母。

图10显示了来自正在运行的发酵罐的真实发酵酵母样品的2个 实例，其中使用所发现的荧光检测方法来清楚地区分玉米醪中存活 的和不存活的酵母。

图11显示了7个不同阶段的发酵样品的一系列荧光图像。

图12显示了本发明和手动计数方法两者的(a)浓度和(b)存 活率相对于发酵持续时间的图。(c)该图显示发酵样品中的酵母的 存活率与乙醇含量的百分比之间的关系。

图13显示了玉米醪样品中的酵母的吖啶橙的非特异性弱荧光信 号的实例和碘化丙锭的非特异性信号的实例。

图14显示了主要与本发明结合使用以测定玉米醪中的酵母存活 率的Cellometer(Nexcelom Bioscience)的图。

图15显示了相对于不同缓冲液而言(a)吖啶橙和(b)碘化丙 锭的信背比(signal-to-background ratio)的图。该方法在超过5小时 的孵育期(c)是稳定的。

图16显示了针对不同浓度的(a)吖啶橙和(b)碘化丙锭的信 背比的图。

具体实施方式

本发明解决了先前方法的缺点，因为可以通过本发明的方法容 易并精确地分析实时样品，如包含玉米醪和其他残渣的来自生物燃 料植物的样品。因为本发明允许高染色特异性，杂乱的样品可以得 到有效地测定。因此，本发明在部分基于用于获得和测定酵母细胞 的存活率和浓度的高效和有效的方法和组合物的发现。

近来，Nexcelom Bioscience(Lawrence，MA)开发了一种新型的成 像细胞计数方法，该方法允许使用仅需要20μl样品的廉价的一次性 计数室快速测定细胞浓度。(Lai等人，“Intratumoral Epidermal Growth  Factor Receptor Antisense DNA Therapy in Head and Neck Cancer： First Human Application and Potential Antitumor Mechanisms，”Journal  of Clinical Oncology，第27卷，第1235-1242页，2009年3月；Nott 等人，“Genomic Responses from the Estrogen-responsive  Element-dependent Signaling Pathway Mediated by Estrogen Receptor  alpha Are Required to Elicit Cellular Alterations，”Journal of Biological  Chemistry，第284卷，第15277-15288页，2009年5月；Qiao等人， “Thiol Oxidative Stress Induced by Metabolic Disorders Amplifies  Macrophage Chemotactic Responses and Accelerates Atherogenesis and  Kidney Injury in LDL Receptor-Deficient Mice，”Arteriosclerosis  Thrombosis and Vascular Biology，第29卷，第1779-U139页，2009年 11月；Rounbehler等人，“Targeting Ornithine Decarboxylase Impairs  Development of MYCN-Amplified Neuroblastoma，”Cancer Research， 第69卷，第547-553页，2009年1月；Shanks等人，“Quantitative PCR  for Genetic Markers of Human Fecal Pollution，”Applied and  Environmental Microbiology，第75卷，第5507-5513页，2009年9月； Stengel等人，“Identification and Characterization of Nesfatin-1  Immunoreactivity in Endocrine Cell Types of the Rat Gastric Oxyntic  Mucosa，”Endocrinology，第150卷，第232-238页，2009年1月。)利 用明视野和荧光成像的结合，该系统可以自动采集细胞图像，并使 用用于精确和一致地测定多种细胞类型的细胞群体和存活率的新型 计数算法进行处理。以前已经报道了下述应用，例如对免疫细胞、 癌细胞、干细胞、昆虫细胞、脂肪细胞、肝细胞、血小板、藻类细 胞和异质细胞的列举、GFP转染的定量、使用台盼蓝或碘化丙锭测 定存活率、测量全血中的白细胞的应用。更重要的是，已证明该方 法在生物燃料、饮料和烘焙业中产生了用于质量控制目的的、一致 的纯酵母的浓度和存活率测定。(Nexcelom Bioscience，“Simpe，Fast  and Consistent Determination of Yeast Viability using Oxonol，” Application Focus：Cellometer Vision 10X，第1-2页。)

本文公开了采用CellometerVision(Nexcelom Bioscience)测 定来自正在运行的发酵罐的玉米醪中的酵母浓度和存活率的新型成 像荧光细胞计数法。使用本发明的稀释缓冲液并用吖啶橙(AO)和 碘化丙锭(PI)对样品进行染色，选择性地标记了存活的和不存活 的酵母，同时消除了来自玉米醪的非特异性荧光信号。该方法使用 直接来自加工中的发酵罐的样品，不需要进一步的过滤处理，可以 高效地进行酵母质量控制，在美国过滤处理对监测稳定的生物乙醇 生产可能具有显著的影响。除了玉米醪，甘蔗发酵中的酵母存活率 也可以使用该方法测定。

一方面，本发明一般地涉及用于测定酵母细胞的浓度的方法。 该方法包括：在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用染料对将 要测定酵母细胞浓度的样品进行染色；获取经染料染色的样品的荧 光图像；分析经染料染色的样品的荧光图像，以确定存活酵母细胞 的浓度。所述染料可选自，例如吖啶橙、SYTO 9、DAPI、Hescht、 Calcofluor白、碘化丙锭、溴化乙锭、Oxonol、Mg-ANS。在一些实 施方式中，染料是浓度为约1μg/mL至约5μg/mL(例如，约1μg/mL 至约4μg/mL、约1μg/mL至约3μg/mL、约2μg/mL至约5μg/mL、 约3μg/mL至约5μg/mL)的吖啶橙。

在一些实施方式中，缓冲液条件具有约10至约12(例如，约 10.5至约12、约10.5至约11.5、约10至约11.5、约10至约11)的 pH。

所述样品可以是任何合适的样品，包括来自生物燃料发酵工艺 (例如，用于生产包括乙醇和/或丁醇的生物燃料)的工业用样品。 样品可包括残渣，如玉米醪和/或甘蔗的残渣。

在某些实施方式中，酵母为酿酒酵母种。

在另一方面，本发明一般地涉及用于确定酵母存活率的方法。 该方法包括：在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第一染料 和第二染料对将要测定酵母存活率的样品进行染色；获取经第一染 料染色的样品的荧光图像；获取经第二染料染色的样品的荧光图像； 并比较经第一染料染色的样品的荧光图像和经第二染料染色的样品 的荧光图像以确定酵母存活率。

例如，该第一染料可选自吖啶橙、SYTO 9、DAPI、Hescht、 Calcofluor白，且该第二染料可选自碘化丙锭、溴化乙锭、Oxonol、 Mg-ANS。

在某些实施方式中，第一染料为吖啶橙且第二染料为碘化丙锭。 例如，吖啶橙的浓度可为约1μg/mL至约5μg/mL(例如，约1μg/mL 至约4μg/mL、约1μg/mL至约3μg/mL、约2μg/mL至约5μg/mL、 约3μg/mL至约5μg/mL)。碘化丙锭的浓度可为约1μg/mL至约5 μg/mL(例如，约1μg/mL至约4μg/mL、约1μg/mL至约3μg/mL、 约2μg/mL至约5μg/mL、约3μg/mL至约5μg/mL)。

在又一方面，本发明一般地涉及用于确定存活酵母细胞的浓度 的方法。该方法包括：在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用 第一染料和第二染料对待测样品进行染色；获取经第一染料染色的 样品的至少一幅静态荧光图像；获取经第二染料染色的样品的至少 一幅静态荧光图像；并分析该经第一染料染色的样品的至少一幅静 态荧光图像和该经第二染料染色的样品的至少一幅静态荧光图像以 确定样品中存活酵母细胞的浓度。

在又一方面，本发明一般地涉及用于确定酵母存活率的方法。 该方法包括：在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第一染料 和第二染料对将要测定酵母存活率的样品进行染色；获取经第一染 料染色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图 像；比较该经第一染料染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一 幅荧光图像以确定样品中存活酵母细胞的特征；获取经第二染料染 色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像；并 比较该经第二染料染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅荧 光图像以确定样品中不存活的酵母细胞的特征。该方法可进一步包 括确定存活酵母细胞的浓度。

在又一方面，本发明一般地涉及用于确定活酵母细胞的浓度的 方法。该方法包括：在pH为约10至约12.5的缓冲液条件下，用第 一染料和第二染料对待测样品进行染色；获取经第一染料染色的样 品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光图像；获取经第 二染料染色的样品的至少一幅静态明视野图像和至少一幅静态荧光 图像；并确定样品中存活酵母细胞的浓度。

在又一方面，本发明一般地涉及用于确定酵母存活率的方法。 该方法包括：在pH为约10.5至约12.5的缓冲液条件下，用吖啶橙 对将要测定酵母存活率的样品进行染色；通过将明视野光束指向样 品获取经吖啶橙染色的样品的至少一幅静态明视野图像；通过将激 发光束指向样品获取经吖啶橙染色的样品的至少一幅静态荧光图 像；比较该经吖啶橙染色的样品的至少一幅明视野图像和至少一幅 荧光图像以确定样品中存活酵母的特征；在约10.5至约12.5的pH 的缓冲液条件下，用碘化丙锭对将要测定酵母存活率的样品进行染 色；通过将明视野光束指向样品获取经碘化丙锭染色的样品的至少 一幅静态明视野图像；通过将激发光束指向样品获取经碘化丙锭染 色的样品的至少一幅静态荧光图像；比较该经碘化丙锭染色的样品 的至少一幅明视野图像和至少一幅荧光图像以确定样品中不存活的 酵母的特征；并确定样品的酵母存活率。

实施例

荧光染色剂的选择

为了优化酵母存活率测定的试验方案，所选择用来确定活或死 细胞的荧光染色剂应该是明亮的并具有低背景信号。使用Cellometer  Vision，利用375nm/450nm、470nm/525nm和527nm/595nm的激 发/发射的对，对8种不同的荧光染色剂进行了比较。所述染料在稀 释至约2×10⁶个颗粒/mL的Munton脱水酵母上进行实验。吖啶橙 (AO)、SYTO 9、DAPI、Hoescht、Calcofluor白是全细胞染色剂，而 Mg-ANS、碘化丙锭(PI)、溴化乙锭(EB)为存活率染料，其可以进入 膜受损的细胞。针对每种染料，进行系列浓度的测试以观察近似的 最佳浓度并分析信背比。

紫外线(375nm)所激发的染料为DAPI、Hoescht、Calcofluor 白和Mg-ANS。DAPI、Hoescht和Calcofluor白染色所有细胞，但由 于酵母包含内膜和外细胞壁的生物结构，使染色情况变得难以预知。 如图1所示，UV染料的结果显示出酵母细胞的非均匀的荧光。对于 Mg-ANS，一种存活性染料，它仅染色死酵母细胞，在较低浓度下具 有均匀的荧光信号。总体而言，紫外染料具有很高的来自基底 (substrate)的自体荧光背景，且低功耗、高亮度UV LED不易获得。

蓝光(470nm)所激发的染料为吖啶橙和SYTO 9，这两种染料 均染色全部细胞，但类似于UV染料，它们会产生非均匀的荧光。 在两种染料的较低浓度下，一些酵母细胞比其他细胞更明亮地染色， 它们对应于膜受损的细胞。(图2)

绿光(527nm)所激发的染料为溴化乙锭和碘化丙锭，它们是 死细胞的存活性染色剂。在高浓度下，每一个细胞中都诱导产生背 景荧光。随着浓度的降低，死细胞的信号增加(图3)。PI具有比 EB低得多的背景荧光。

总体而言，AO、SYTO 9更适合于全细胞染色而PI更适合于死 细胞染色。因此，为针对杂乱样品进行优化，进一步探讨了这三种 染料。

pH值的优化

以前，已经采用SYTO 9和PI测定酵母的存活率(Invitrogen)， 且通过使用Cellometer Vision，可得到一致的结果。SYTO 9和PI的 最佳浓度分别为约3μM和41μg/mL。(图4)

SYTO 9和PI对脱水的酵母均很好地染色，但当测试玉米醪中 的酵母时，AO和SYTO 9均不能很好地染色活细胞。此外，如图5 所示，显示了高荧光背景，其中残渣明亮地发光，使自动计数不可 能进行。

通常，由AO所产生的荧光信号要比SYTO 9所产生的好得多， 因此将进行pH系列试验(图6和图7)。结果显示，在pH大于8 时，残渣的背景荧光被消除(类似于蜜蜂孢子)且活细胞被明亮地 染色。

AO和PI混合物的浓度优化

活细胞的AO染色可以通过优化缓冲液的pH值来调整，但同时， 也必须补偿PI浓度以淬灭死细胞中的AO荧光。此外，PI也染色残 渣，因此可调整浓度以减少残渣信号。(图8)

发酵样品的测定

对玉米醪中的酵母的几个发酵阶段测试在调整的pH下的AOPI 混合物。对发酵2测试了大量的计数以检查该方案的一致性。首先 将10μL的发酵样品与5μL的各为5μg/mL的AO和PI混合，最后 用5μL的0.05M的NaOH调节pH。对发酵2进行了超过11次试验， 计算得到19.24％+/-2.35％存活率的平均值。此外，酵母样品用所调 整的pH值进行预稀释，然后将10对10μL的样品和AOPI染色剂 1∶1混合1分钟。在孵育1分钟后，将溶液吸移到低FL背景片中并 插入Cellometer Vision中。经过2-3分钟，背景残渣荧光扩散出去， 在AO通道中只留下明亮的活细胞，而低浓度的PI将明亮地染色死 细胞，而残渣也未染色。(图9)

缓冲液的选择

通过使用NaOH将酵母样品和染色剂的pH直接改变为约10而 进行了某些试验，但选择在对于一致的荧光检测和浓度测定最佳的 pH值和离子强度下稳定的缓冲液是必要的。选择Trizma碱和Trizma  8.8来测试在没有最低背景的情况下染色酵母的能力。(图10)

Trizma碱产生pH值约为10的缓冲液并用水稀释至0.1M，其 对于AO和PI通道都产生干净的背景。然而Trizma 8.8没有高到足 以最小化背景以及增强酵母信号。残渣的背景信号仍然可以观察到， 在AO通道中也可以观察到死酵母，这造成了活细胞和死细胞之间 的一定的混淆。

玉米醪中的酵母的表征

所提供的酵母和玉米醪的混合物首先通过测定各个样品的pH 值和乙醇含量进行表征。样品1-7的平均pH值为4.45+/-0.18，乙醇 含量分别从1.8％至14.7％递增。由于酵母的pH耐受性高，在每个样 品中的低pH值可以防止细菌污染。一般而言，在发酵过程中，随着 发酵罐中乙醇百分比的增加，酵母的存活率降低，这最终终止生物 乙醇的产生。因此，如果在不同发酵阶段可以容易地监测酵母的存 活率，则当试图延长酵母的生命周期时，可实现较高的最终乙醇产 出。

将本发明的稀释缓冲液与细胞培养级的H₂O和PBS相比，以获 得最高的荧光信号以及低背景水平。图12a显示了对于AO和PI， 酵母的信背比。对于PI染色，所有三种溶液对于不存活的细胞显示 了相当的信背比，但对于H₂O和PBS，玉米醪残渣的非特异性荧光 较高。AO荧光在稀释缓冲液之间具有最大差异，其中，H₂O和PBS 对活细胞不显示任何的荧光信号。与此相反，在本文所公开的缓冲 液中稀释的酵母表现出强烈的AO荧光并且对于不存活的细胞表现 出最小的信号，这证实了AO到PI的荧光共振能量转移。

浓度系列的结果显示于图12b中，其中对于AO和PI在每个浓 度都显示出高信背比。也比较了来自残渣的非特异性荧光和背景荧 光。随着两种染料浓度的下降，来自玉米醪残渣的非特异性荧光也 下降。出于其显示出高信背比和低非特异性荧光信号这一事实，对 于AO和PI优化的浓度为约1.25μg/mL。通过增加或降低AO∶PI的 浓度比，可改变酵母的荧光响应(数据未示出)。如果AO的浓度 高于PI，则随着残渣非特异性信号的增加，AO将发出更明亮的荧光。 更重要的是，PI不足以淬灭来自不存活的细胞的AO信号，该信号 导致活酵母和死酵母之间较差的区分。然而，如果AO的浓度超过 20μg/mL，则由于抑制自身荧光的二聚体的形成，可能发生AO分子 的自淬灭。另一方面，如果AO的浓度低于PI，AO信号会变弱，但 会在活酵母和死酵母之间提供良好的区分。因此，通过保持AO和 PI在同一浓度消除了AOPI混合物不平衡的问题。

使用所选择的缓冲液和优化的染料浓度，按照Cellometer成像 细胞计数法测定每种酵母样品的浓度和存活率。图13显示了七个酵 母样品的明视野图像和荧光图像的实例。每个荧光图像分别为来自 AO和PI通道的荧光信号与伪颜色(pseudo colors)绿色和橙色的组 合。计过数的酵母细胞被软件圈出来，这明确地区分了活细胞、不 存活的细胞和残渣。被有效染色的酵母细胞具有高荧光强度，而玉 米醪非特异性信号被最小化。对样品1-7计算的平均总细胞浓度分别 为0.41、1.33、1.20、0.94、1.31、1.32和0.97×10⁸个颗粒/mL，而平 均存活率测定值分别为83.8％、90.4％、94.0％、75.9％、80.8％、60.9％ 和24.1％。使用手动细胞计数法测定的样品1-7的平均总细胞浓度分 别为0.54、1.43、1.31、0.78、1.18、1.14、0.85×10⁸个颗粒/mL，且 平均存活率测定值分别为80.0％、90.7％、85.9％、72.3％、80.5％、 60.3％和19.5％(图13)。

虽然由于稠混合物的移液不足，两个样品(1和4)显示出较低 的细胞浓度，但从Cellometer和细胞计数器两者中所获得的结果是 一致的。除样品1和样品4以外，其他样品对Cellometer和细胞计 数器分别表现出1.18×10⁸和1.22×10⁸个颗粒/mL的平均值，这显示 了新型成像细胞计数方法在样品之间的一致性。由于初始酵母和玉 米醪样品用稀释缓冲液进行了1∶20(v/v)的稀释，因此得到的计数 结果自动乘以因子20。

浓度测定的移液误差并不影响本试验中的存活率测定，因为存 活细胞和不存活细胞的细胞计数比得到了适当地测定。由于乙醇百 分比的增加，存在存活率降低的总趋势，这在图14中绘制出来。在 本实验中，Cellometer能够证明在整个发酵过程中存活率的降低。在 细胞培养级H₂O中稀释的对照样品，由于弱的活细胞荧光信号和来 自玉米醪的非特异性荧光信号，显示出很差的成像结果(图15)。

利用CellometerVision和本发明的稀释缓冲液的结合直接测定 发酵罐中的酵母浓度和存活率对美国的生物燃料产业具有十分重要 的意义。准确地测定发酵罐中的酵母的存活率将使生物燃料工厂能 够产生一致的生物乙醇产出。此外，这将促进发酵罐之间的一致性 并提高乙醇生产的效率。另一个优点是缩短花费在手工细胞计数上 的时间，通过使用成像细胞计数法，训练有素的技术人员可以很容 易地在不到10分钟内安装和运行多个样品。一般而言，仅在发酵过 程的前2-3小时计数酵母浓度。可以容易地引入这种新型成像细胞计 数方法的效率和有效性以在整个发酵过程中监测酵母存活率。

以前已经证明了CellometerVision是准确和稳定的纯酵母浓度 和存活率测定 (http://www.nexcelom.com/Applications/Yeast-Viability.html)，例如， 测定玉米醪中的酵母浓度和存活率的能力，其中从存活酵母细胞和 不存活的酵母细胞检测和计数强荧光信号，而玉米醪的非特异性染 色得到最小化，以促进有效的自动细胞计数算法。结合使用 CellometerVision和稀释缓冲液的计数试验的开发为美国生物燃料 工业提供了在发酵过程中一致且精确地监测酵母存活率以确保高质 量的生物乙醇产出的新方法。此外，在生物燃料工厂引入这种新型 成像细胞计数方法可以支持提高生物乙醇生产的研究，随着化石燃 料的减少和全球变暖问题的加剧，这将成为一个重要的发展。 (Pretorius等人，“Designer Yeasts for the Fermentation Industry of the  21^st Century，”Food Technology Biotechnology，第41卷，第3-10页， 2003年；Graves等人，“Effect of pH and lactic or acetic acid on ethanol  productivity by Saccharomyces cerevisiae in corn mash，”Journal of  Industrial Microbiology and Biotechnology，第33卷，第469-474页， 2006年；Graves等人，“Interaction effects of lactic acid and acetic acid  at different temperatures on ethanol production by Saccharomyces  cerevisiae in corn mash，”Applied Microbiology and Biotechnology，第 73卷，第1190-1196页，2007年。)

示例性方法

稀释缓冲液和荧光试剂

0.1M的磷酸盐缓冲液(PBS)(Sigma Aldrich)和细胞培养级H₂O 也用来同本发明的缓冲液进行比较。

荧光染色剂AO和PI均为核染色剂并购自Biolegend(San Diego， CA)。AO是阳离子膜透性染料，单独使用时，以绿色荧光标记所有 细胞，而PI是完整膜不透性染料，其容易渗透膜受损的不存活的细 胞，产生橙色荧光。(Foglieni等人，“Fluorescent dyes for cell viability： an application on prefixed conditions，”Histochemical Cell Biology，第 115卷，第223-229页，2001年；Ling等人，“Classification of larval  circulating hemocytes of the silkworm Bombyx mori，by acridine orange  and propidium iodide staining，”Histochemical Cell Biology，第120卷， 第505-511页，2003年；Mascotti等人，“HPC viability measurement： trypan blue versus acridine orange and propidium iodide，”Transfusion， 第40卷，第693-696页，2000年；Solomon等人，“Factors influencing  cord blood viability assessment before cryopreservation，”Transfusion， 第50卷，第820-830页，2010年；Wallen等人，“Comparison of Two  Flow Cytometric Assays for Cellular RNA-Acridine Orange and  Propidium Iodide，”Cytometry，第3卷，第155-160页，1980年。)由 于AO发射光谱的相当一部分与PI激发光谱重叠且两种染料均位于 不存活细胞的细胞核中，因此当AO和PI同时使用时会发生荧光共 振能量转移(FRET)。FRET是一种量子力学现象，其中无辐射的能量 从供体(AO)转移到受体(PI)。在这种情况下，当AO以高量子产率被 激发时，荧光能量转移，从而激发不存活的细胞中的PI，这淬灭了 它们的AO信号。(Gordon等人，“Quantitative Fluorescence Resonance  Energy Transfer Measurments Using Fluorescence Microscopy，” Biophysical Journal，第74卷，第2702-2713页，1998年；Koksch等人， “Fluorescence resonance energy transfer as a new method for the  epitope-specific characterization of anti-platelet antibodies，”Journal of  Immunological Methods，第187卷，第53-67页，1995年；Periasamy， “Fluorescence resonance energy transfer microscopy：a mini review，” Journal of Biomedical Optics，第6卷，第287-291页，2201年；Selvin 等人，“Luminescence energy transfer using a terbium chelate： Improvements on fluorescence energy transfer，”Proceedings National  Academy of Science，第91卷，第10024-10028页，1994年。)AOPI 组合的特殊光学性质使得可以明确地区分存活细胞和不存活的细 胞。

酵母样品制备

酵母和玉米醪的混合物由Lincolnway Energy(Nevada，IA)提供。 在发酵前[2.65h和8h(样品1-2)]以及发酵过程中[2.5h、10h、39 h、45h和55h(样品3-7)]，从各个发酵罐中收集七种酵母和玉米 醪混合物置于500mL聚丙烯瓶中用于浓度和存活率测定[来自生物 燃料联系者的信息]。针对每个样品测定乙醇百分比和pH值，即[所 需信息]。每个样品用稀释缓冲液、PBS及细胞培养级H₂O以1∶20 (v/v)稀释并装入50mL离心管中。由于酵母混合物为泥浆状溶液， 在稀释前必须充分振荡瓶子。

CellometerVision平台和一次性计数室

CellometerVision采用一个明视野和两个荧光通道进行图像细 胞计数分析(图11)。对于AO通道，激发和发射滤波片组分别为 475nm和535nm。对于PI通道，激发和发射滤波片组分别为540nm 和670nm。Cellometer系统自动在两个通道之间切换以测定存活细 胞和不存活细胞的浓度，并生成每个样品的存活率。

一次性计数室正好容纳20μL样品(图12)。四个独立的区域 在计数室上进行成像和分析，这通过计数算法进行，从而产生准确 和一致的浓度结果。

缓冲液的选择

比较在Nexcelom稀释缓冲液、PBS和细胞培养级H₂O(如上所 述)中稀释的酵母和玉米醪混合物的荧光信号，以便为浓度和存活 率测定选择最佳的缓冲液。随机选择酵母样品2(10μL)并用10 μg/mL的AOPI混合物(10μL)染色以检查信背比。

荧光染料浓度优化

通过在所选定的优化缓冲液中进行两种染料的浓度系列测试来 对AO和PI的浓度进行优化。使用酵母样品2，通过混合10μL酵 母和10μL染料，以20、10、5、2.5和1.25μg/mL(终浓度)测试 这两种染料，其中最佳浓度应该对活细胞产生明亮的AO荧光信号 或高信背比，而由于PI的淬灭效应对不存活的细胞产生暗淡的信号。 不存活的细胞在PI通道中应该是明亮的，而存活细胞应该是暗淡的。

浓度和存活率测定方案

在预混酵母样品和稀释缓冲液后，通过上下颠倒10次在离心管 中混合。然后将每个酵母样品(10μL)与10μL的2.5μg/mL的AOPI 混合物混合，并将其孵育2-3分钟。然后将染色的酵母样品(20μL) 吸移到细胞计数室内并使之沉降。然后，使用CellometerVision一 式三份计数和分析每个样品。

手动细胞计数仪计数方法

针对7个样品中的每一个，从CellometerVision平台捕获的图 像在两个Cellometer计数室中进行手动计数。然后将所得的浓度和 存活率结果与用软件自动计数的结果进行比较。

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援引并入

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等价方案

代表性实例旨在帮助阐明本发明，并不打算也不应解释为限制 本发明的范围。实际上，根据本文的全部内容(包括实施例和包含 在其中的对科学和专利文献的引用)，除了本文示出和描述的实施 方式之外，本发明的各种修改及其许多进一步的实施方式对于本领 域技术人员将是显而易见的。这些实施例包含重要的附加信息、示 例和指导，其可适于在其各种实施方式及其等同物中实施本发明。