含硫氨基酸生产菌以及含硫氨基酸的制造方法

摘要

开发提高细菌的生产含硫氨基酸的能力的新技术，提供含硫氨基酸生产菌、以及使用该细菌的含硫氨基酸等化合物的制造方法。通过在培养基中培养具有生产含硫氨基酸的能力，且经过修饰而增强了yeeE基因编码的蛋白质、例如下述(A)或(B)所述的蛋白质的活性的属于肠杆菌科的细菌，并从该培养基收集含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物，来制造这些化合物。(A)由SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列组成的蛋白质。(B)在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中，包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列由组成的、且增强在细胞内的活性时生产含硫氨基酸的能力提高的蛋白质。

说明书

技术领域

本发明涉及L-半胱氨酸等含硫氨基酸或其关联物质的制造方法，具体涉 及适于含硫氨基酸或其关联物质的制造的细菌、以及使用该细菌的含硫氨基 酸或其关联物质的制造方法。含硫氨基酸及其关联物质可用于医药品、化妆 品以及食品领域。

背景技术

L-半胱氨酸通常通过从例如毛发、角和羽毛等含有角蛋白质的物质中提 取而获得，或者使用微生物酶转化前体DL-2-氨基噻唑啉-4-羧酸通过而获 得。此外，还计划使用新型酶通过固定化酶方法大规模生产L-半胱氨酸。此 外，还尝试通过使用微生物的发酵来生产L-半胱氨酸。

作为具有生产L-半胱氨酸能力的微生物，已知有例如胞内丝氨酸乙酰转 移酶活性增加的棒状杆菌型细菌(专利文献1)。还已知一种通过并入削弱了 L-半胱氨酸反馈抑制的突变型丝氨酸乙酰转移酶增加L-半胱氨酸生产能力 的技术(专利文献2～4)。

此外，作为通过抑制起分解L-半胱氨酸作用的系统来提高L-半胱氨酸 生产能力的微生物，已知削弱或缺失了胱硫醚-β-裂合酶(专利文献2)、色氨 酸酶(专利文献5)或O-乙酰丝氨酸硫化氢解酶B(专利文献6)的活性的棒状 杆菌型细菌或埃希氏菌属(Escherichia)细菌。

此外，已知编码YdeD蛋白的ydeD基因参与了L-半胱氨酸途径代谢产 物的分泌(非专利文献1)。此外，还已知通过增加mar基因座、emr基因座、 acr基因座、cmr基因座、mex基因、bmr基因或qacA基因(专利文献7)，或 emrAB、emrKY、yojIH、acrEF、bcr或cusA基因的表达来提高L-半胱氨酸 生产能力(专利文献8)的技术，这些基因座/基因编码适于从细胞分泌细胞毒 性物质的蛋白质。

此外，作为L-半胱氨酸生产菌，还已知cysB基因编码的半胱氨酸调节 子的正向转录调控因子的活性增加的大肠杆菌(Escherichia coli)(专利文献 9)。

此外，还已知削弱了丝氨酸反馈抑制的编码3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变 型serA，并且提出通过将该突变型serA用于通过大肠杆菌进行的L-半胱氨 酸生产(专利文献10和11)。

此外，甲硫氨酸在工业上主要是通过化学合成以DL体的形式制造。在 必需L体的情况下，通过将DL体乙酰基化为N-乙酰基-DL-甲硫氨酸，再 采用酶法仅将L体脱乙酰基化来制造。而且，也尝试了通过使用微生物的发 酵方法来进行L-甲硫氨酸的生产。作为L-甲硫氨酸生产菌，已知有：L-甲 硫氨酸生物合成系统的阻遏物缺损、细胞内的高丝氨酸转琥珀酰基酶活性增 强、且细胞内的S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性弱化、显示L-苏氨酸营养缺陷 性、细胞内的胱硫醚γ-合酶活性以及天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II活性 增强的大肠杆菌(专利文献12)等。

yeeE基因作为编码推定涉及跨膜的蛋白质(putative transport system  permease protein)的基因在数据库EcoCyc(非专利文献2)中登录。此外，使用 膜蛋白质预测程序SOSUI(http： //bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/sosui_submit.html)进行解析，预测YeeE为9次 跨膜型膜蛋白质。因而，推定其为某种转运子，但其实际功能不明，也未知 其与含硫氨基酸生产的关系。

此外，有报告称，yeeE基因在下述条件时上调：镉(非专利文献3)、锌(非 专利文献4)、CO释放剂CORM-2(非专利文献5)、RpoE依赖性地在稳定期 早期(非专利文献6)、以及人体温37℃的温度条件(非专利文献7)。此外，有 报告称，其因乙酸(非专利文献8)、熊果酸(非专利文献9)，或者在IHF(-)株 中(非专利文献10)下调。然而，上述均是仅仅作为在微阵列实验中表达有变 化的众多基因中的一个而列举，并未提示与含硫氨基酸生产的关系。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：特开2002-233384号公报

专利文献2：特开平11-155571号公报

专利文献3：美国专利申请公开第20050112731号

专利文献4：美国专利第6218168号

专利文献5：特开2003-169668号公报

专利文献6：特开2005-245311号公报

专利文献7：美国专利第5972663号

专利文献8：特开2005-287333号公报

专利文献9：国际公开小册子第01/27307号

专利文献10：美国专利第5856148号

专利文献11：美国专利申请公开第20050009162号

专利文献12：美国专利第7611873号

非专利文献

非专利文献1：Dassler et al.，Mol.Microbiol.36，1101-1112(2000)

非专利文献2：BioCyc Home Page，Escherichia coli K-12substr. MG1655Gene：yeeE[平成22年7月13日检索]、互联网<http： //biocyc.org/ECOLI/NEW-IMAGE·type=GENE&object=EG11895>

非专利文献3：Kerstin et al.，J.Bacteriol.，Aug2008；190：5439 -5454

非专利文献4：Kaneyoshi et al.，J.Bacteriol.，Sep2005；187：6333 -6340

非专利文献5：Ligia S.Nobre et al.，Microbiology，Mar2009；155： 813-824

非专利文献6：Md.Shahinur Kabir et al.，Microbiology，Aug2005； 151：2721-2735.

非专利文献7：Christine A.et al.，J.Bacteriol.，Aug2007；189：5429 -5440

非专利文献8：Carrie N.Arnold et al.，J.Bacteriol.，Apr2001；183： 2178-2186.

非专利文献9：Dacheng Ren et al.，Appl.Envir.Microbiol.，Jul2005； 71：4022-4034.

非专利文献10：Stuart M.Arfin et al.，J.Biol.Chem.，Sep2000；275： 29672

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的课题是开发提高细菌的生产含硫氨基酸的能力的新技术，提供 含硫氨基酸生产菌、以及使用该细菌的含硫氨基酸或其关联物质、或它们的 混合物的制造方法。

解决问题的方法

本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：通过对细菌进行 修饰而增强yeeE基因编码的蛋白质的活性，能够提高生产含硫氨基酸的能 力，从而完成了本发明。

即，本发明如下。

(1)具有生产含硫氨基酸的能力、且经过修饰而增强了yeeE基因编码的 蛋白质的活性的属于肠杆菌科的细菌。

(2)所述细菌，其中，通过增大yeeE基因的表达量、或增大yeeE基因的 翻译量，增强所述蛋白质的活性。

(3)所述细菌，其中，通过提高yeeE基因的拷贝数、或修饰该基因的表 达调控序列，增大yeeE基因的表达量。

(4)所述细菌，其中，所述蛋白质是下述(A)或(B)所述的蛋白质。

(A)由SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

(B)具有在SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列中，包含1个或数个氨基 酸的取代、缺失、插入或添加的氨基酸序列，且增强在细胞内的活性时生产 含硫氨基酸的能力提高的蛋白质。

(5)所述细菌，其中，所述yeeE基因是下述(a)或(b)所述的DNA。

(a)由SEQ ID NO：13所示的碱基序列组成的DNA、或

(b)能够在严格条件下与SEQ ID NO：13所示的碱基序列的互补碱基 序列或能够由该碱基序列制备的探针杂交，且编码增强在细胞内的活性时生 产含硫氨基酸的能力提高的蛋白质的DNA。

(6)而且，所述细菌，具有下述性质中的至少任意一个。

i)经过修饰而提高了丝氨酸乙酰转移酶活性。

ii)经过修饰而提高了ydeD基因的表达。

iii)经过修饰而提高了3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。

(7)所述细菌，其中，所述细菌是埃希氏菌属细菌。

(8)所述细菌，其中，所述细菌是大肠杆菌。

(9)所述细菌，其中，所述细菌是泛菌属细菌。

(10)所述细菌，其中，所述细菌是Pantoea ananatis。

(11)含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物的制造方法，其中，将 所述细菌在培养基中进行培养，并从该培养基收集含硫氨基酸或其关联物 质、或它们的混合物。

(12)所述方法，其中，所述含硫氨基酸是L-半胱氨酸。

(13)所述方法，其中，所述含硫氨基酸是L-半胱氨酸，所述关联物质是 胱氨酸或噻唑烷衍生物。

发明效果

根据本发明，能够提高细菌的生产含硫氨基酸的能力。此外，根据本发 明，高效率地制造含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物。

附图说明

[图1]显示野生型nlpD启动子(Pnlp：SEQ ID NO：15)、以及突变型nlpD 启动子(Pnlp8：SEQ ID NO：16)与yeaS基因的连接位点的序列的图。

发明的具体实施方式

<1>本发明的细菌

本发明的细菌是具有生产含硫氨基酸的能力，且经过修饰使得增强了 yeeE基因编码的蛋白质的活性的属于肠杆菌科的细菌。

作为含硫氨基酸，可以列举出L-半胱氨酸以及L-甲硫氨酸，优选L-半 胱氨酸。此外，本发明的细菌可以具有L-半胱氨酸以及L-甲硫氨酸这两者 的生产能力。

此外，在本发明中，含硫氨基酸是指：游离体的含硫氨基酸或其盐、或 它们的混合物。作为盐，可以列举出例如硫酸盐、盐酸盐、碳酸盐、铵盐、 钠盐、钾盐。

这里，生产含硫氨基酸的能力是指：当在培养基中培养本发明的细菌时， 在培养基中或者菌体内生成含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物，并 且蓄积达到可以从培养基中或者菌体回收的水平的能力。此外，具有生产含 硫氨基酸的能力的细菌是指：与野生株或者亲本株相比可以生产更多量的含 硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物并使其在培养基中蓄积的细菌，优 选可以生产并在培养基中蓄积0.05g/L以上，更优选为0.1g/L，特别优选为 0.2g/L以上的量的含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物的细菌。

在含硫氨基酸为L-半胱氨酸的情况下，有时细菌产生的L-半胱氨酸在 培养基中通过二硫键部分转化为L-胱氨酸。此外，有时L-半胱氨酸通过和 培养基中含有的硫代硫酸反应生成S-磺酸半胱氨酸(Szczepkowski T.W.， Nature，vol.182(1958))。进一步，细菌的细胞内生成的L-半胱氨酸有时还 和细胞中存在的酮或醛，例如与丙酮酸缩合，以硫代半酮缩醇(hemithioketal) 为中间体生成噻唑烷(thiazolidine)衍生物(参考日本专利第2992010号)。这些 噻唑烷衍生物以及硫代半酮缩醇有时作为平衡混合物存在。此外，L-半胱氨 酸可以用作γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸等的生物合 成起始物质。因此，通过使用除了具有L-半胱氨酸生产能力之外、还具有产 生这些化合物的能力的细菌，能够制造这些化合物。在本发明中，L-半胱氨 酸生产能力不限于在培养基中或菌体内仅蓄积L-半胱氨酸的能力，包括在培 养基中蓄积L-半胱氨酸、L-胱氨酸、如所述的L-半胱氨酸的衍生物(例如S- 磺酸半胱氨酸、噻唑烷衍生物、硫代半酮缩醇)、或经由如所述的L-半胱氨 酸生产的其他化合物(例如γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱 氨酸)、或它们的混合物的能力。此外，在本发明中，L-胱氨酸、如所述的 L-半胱氨酸的衍生物、以及经由如所述的L-半胱氨酸生产的其他化合物统称 为L-半胱氨酸的关联物质。

L-甲硫氨酸是以L-半胱氨酸作为起始物质之一生物合成的含硫氨基酸。 此外，L-甲硫氨酸可用作S-腺苷甲硫氨酸等的生物合成起始物质。因此，在 含硫氨基酸为L-甲硫氨酸的情况下，通过使用除了L-甲硫氨酸生产能力之 外、还具有生产S-腺苷甲硫氨酸等的能力的细菌，能够制造S-腺苷甲硫氨 酸等。在本发明中，L-甲硫氨酸生产能力不限于在培养基中或菌体内仅蓄积 L-甲硫氨酸的能力，包括在培养基中蓄积L-甲硫氨酸、或经由L-甲硫氨酸 生产的其他化合物(例如S-腺苷甲硫氨酸)、或它们的混合物的能力。在本发 明中，如所述的经由L-甲硫氨酸生产的其他化合物称为L-甲硫氨酸的关联 物质。

在本发明中，生产含硫氨基酸的能力是指：在培养基中蓄积L-半胱氨酸、 L-半胱氨酸的关联物质、L-甲硫氨酸、或L-甲硫氨酸的关联物质、或它们的 混合物的能力。此外，在本发明中，L-半胱氨酸的关联物质与L-甲硫氨酸的 关联物质也统称为含硫氨基酸的关联物质。

作为具有生产含硫氨基酸的能力的细菌，可以是天然具有生产含硫氨基 酸的能力，也可以对诸如下述的细菌采用突变法、重组DNA技术进行修饰 而使其具有生产含硫氨基酸的能力。

对本发明中使用的细菌没有特殊限制，只要是属于如埃希氏菌属、肠杆 菌属(Enterobacter)、泛菌属(Pantoea)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌 属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)和摩根氏菌属 (Morganella)等的肠杆菌科，并且具有生产L-氨基酸的能力的细菌即可。具 体地，可以使用按照NCBI(美国国家生物技术信息中心，National Center for  Biotechnology Information)数据库中使用的分类归入肠杆菌科的细菌(http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)。作为用 于修饰的属于肠杆菌科的亲本株，期望使用埃希氏菌属细菌、肠杆菌属细 菌、泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌、肠杆菌属细菌、或克雷伯氏菌属细菌。

尽管对于埃希氏菌属细菌没有特别限制，但是具体而言，可以使用 Neidhardt等的著作(Backmann，B.J.1996.Derivations and Genotypes of some  mutant derivatives of Escherichia coli K-12，p.2460-2488.Table1.In F.D. Neidhardt(ed.)，Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular  Biology/Second Edition，American Society for Microbiology Press， Washington，D.C.)中记载的细菌。在这些细菌中，例如可使用大肠杆菌。 大肠杆菌的具体实例包括源自原型野生型K12菌株的大肠杆菌W3110 (ATCC27325)和大肠杆菌MG1655(ATCC47076)等。

这些菌株可从例如美国典型培养物保藏中心(地址12301Parklawn  Drive，Rockville，Maryland20852P.O.Box1549，Manassas，VA20108， United States of America)获得。即，对每种菌株都给予了登录号，并且可以 使用这些登录号订购菌株(参考http：//www.atcc.org/)。美国典型培养物保 藏中心的目录中列出了各菌株的登录号。

肠杆菌属细菌的实例可以包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans) 和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等。作为肠杆菌属的代表性株，可以 列举出成团肠杆菌ATCC12287株。此外，具体地，可以使用欧洲专利申请 公开952221号说明书中示例的菌株。

作为泛菌属细菌，可以列举出例如Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoea  stewartii)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)、柠檬泛菌(Pantoea citrea)。

Pantoea ananatis的具体实例包括Pantoea ananatis AJ13355株、SC17 株。SC17株是以作为低pH下能够在含L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的 菌株从静冈县磐田市的土壤中分离出来的菌株AJ13355(FERM BP-6614)为 起始，作为粘液质低生产突变株选择出来的菌株(美国专利第6，596，517 号)。Pantoea ananatis AJ13355株于平成10年2月19日在通产省工业技术院 生命工学工业技术研究所(现名称：产业技术综合研究所专利生物保藏中心， 地址：邮政编码305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)保藏， 保藏号FERM P-16644，并于平成11年1月11日转为基于布达佩斯条约的 国际保藏，保藏号FERM BP-6614。此外，Pantoea ananatis SC17株于平成 21年2月4日在产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址邮政编码 305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)保藏，保藏号FERM  BP-11091。而且，Pantoea ananatis AJ13355株在分离时被鉴定为成团肠杆菌 (Enterobacter agglomerans)，并当作成团肠杆菌AJ13355进行了保藏。但是， 近年来，基于16S rRNA碱基序列分析等，其被重新分类为Pantoea ananatis。

作为欧文氏菌属细菌，可以列举出解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora)、 胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)，作为克雷伯氏菌属细菌，可以列 举出植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)。

而且，特别是，泛菌属细菌、欧文氏菌属细菌和肠杆菌属细菌是分类为 γ-变形细菌(γ-Proteobacteria)的细菌，它们在分类学上的亲缘关系非常近(J Gen Appl Microbiol1997Dec；43(6)355-361，International Journal of  Systematic Bacteriology，Oct.1997，p1061-1067)。近年来，依据DNA-DNA 杂交实验等，属于肠杆菌属的细菌中，有些被重新分类为成团泛菌(Pantoea  agglomerans)或分散泛菌(Pantoea dispersa)等(International Journal of  Systematic Bacteriology，July1989；39(3).p.337-345)。此外，属于欧文氏菌 属的细菌中，有些被重新分类为菠萝泛菌(Pantoea ananas)、斯氏泛菌 (Pantoea stewartii)(参照International Journal of Systematic Bacteriology，Jan 1993；43(1)，p.162-173)。在本发明中，只要分类为肠杆菌科即可，可以属 于肠杆菌属、泛菌属或欧文氏菌属等。

以下，针对赋予属于肠杆菌科的细菌生产含硫氨基酸的能力的方法、或 增强这些细菌的生产含硫氨基酸的能力的方法进行说明。

为了向细菌赋予生产含硫氨基酸的能力，可以使用在棒状杆菌型细菌 或埃希氏菌属细菌等的选育中常规使用的方法，这些方法包括获取营养缺 陷型突变株、类似物抗性菌株或代谢调节突变株，或创建含硫氨基酸生物 合成系统酶表达增强的重组菌株等等(参见《アミノ酸発酵》，(株)学会出 版中心，1986年5月30日第一版发行，第77-100页)。这里，在含硫氨基 酸生产菌的选育中，可以赋予上述性质例如营养缺陷性、类似物抗性和代 谢调节突变中的一种、两种或者三种以上。此外，表达被增强的含硫氨基 酸生产菌生物合成系统酶可以是单独一种，也可以是两种或三种以上。另 外，可以将例如营养缺陷性、类似物抗性和代谢调节突变等性质的赋予与 生物合成系统酶的增强组合进行。

具有生产含硫氨基酸的能力的营养缺陷突变体菌株、含硫氨基酸类似 物抗性菌株或代谢调节突变株可如下获得：对亲本菌株或野生型菌株施以 常规诱变处理，例如暴露于X-射线或紫外线照射或用诱变剂例如N-甲基 -N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或者甲磺酸乙酯(EMS)等处理；其后，从所得的 突变株中选择显示营养缺陷性、类似物抗性或代谢调节突变并且还具有生 产含硫氨基酸的能力的菌株。

以下，针对赋予属于肠杆菌科的细菌生产含硫氨基酸的能力的方法、或 增强这些细菌的生产含硫氨基酸的能力的方法、以及具有生产含硫氨基酸的 能力的细菌进行具体示例。

L-半胱氨酸生产能力的赋予或增强、以及L-半胱氨酸生产菌

通过增强L-半胱氨酸生物合成途径的酶，或，与生成如L-丝氨酸等作 为该途径的底物的化合物相关的酶，例如，3-磷酸甘油酸脱氢酶或丝氨酸乙 酰转移酶等的活性，可以提高细菌的L-半胱氨酸生产能力。3-磷酸甘油酸脱 氢酶受到丝氨酸的反馈抑制，通过使细菌携带有编码该反馈抑制被削弱或消 除了的突变型3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变型serA基因，可以增强该酶的酶 活性。此外，丝氨酸乙酰转移酶受到L-半胱氨酸的反馈抑制。因此，通过使 细菌携带有编码该反馈抑制被削弱或消除了的丝氨酸乙酰转移酶的突变型 cysE基因，可以增强该酶的酶活性。

此外，L-半胱氨酸生产能力还可以通过提高编码YdeD蛋白的ydeD基 因(Dabler等，Mol.Microbiol.，36，1101-1112(2000))、或者编码YfiK 蛋白的yfiK基因(特开2004-49237)、或者编码YeaS蛋白的yeaS基因(欧洲 专利申请公开第1016710号说明书)的表达而增强。

L-半胱氨酸生产菌优选具有下述性质中的至少任意一个。

i)经过修饰而提高了丝氨酸乙酰转移酶活性。

ii)经过修饰而提高了ydeD基因的表达。

iii)经过修饰而提高了3-磷酸甘油酸脱氢酶活性。

此外，通过增强硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的活性，也可以提高L-半 胱氨酸的生产能力。硫酸盐/硫代硫酸盐输送系统的蛋白质群由cysPTWAM 基因簇编码(特开2005-137369号公报，EP1528108号说明书)。

L-半胱氨酸生产菌的实例可以列举出但不限于：用编码反馈抑制抗性 的丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的多种cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15菌 株(美国专利第6，218，168号)，具有编码适于分泌细胞毒性物质的蛋白 质的过表达基因的大肠杆菌W3110菌株(美国专利第5，972，663号)，半 胱氨酸脱巯基酶(cysteine desulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(日本特 开平11-155571号公报)，和由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正向转录 调控因子活性增加的大肠杆菌W3110菌株(WO01/27307)等属于埃希氏菌 属的菌株；以及，具有含ydeD基因、突变型cysE基因和突变型serA5基因 的质粒pACYC-DES的大肠杆菌(日本特开2005-137369号公报 (US20050124049(A1)、EP1528108(A1)))等。pACYC-DES为通过将上述三种 基因插入pACYC184所得到的质粒，每个基因的表达通过PompA启动子调 控。

作为具有大肠杆菌的半胱氨酸脱巯基酶活性的蛋白质，已知胱硫醚-β- 裂合酶(metC产物，日本特开平11-155571号公报，Chandra等，Biochemistry， 21(1982)3064-3069)、色氨酸酶(tnaA产物，日本特开2003-169668号公报， Austin Newton等，J.Biol.Chem.，240(1965)1211-1218))、O-乙酰丝氨酸 硫化氢解酶B(cysM基因产物，日本特开2005-245311号公报)和malY基因 产物(日本特开2005-245311)。通过降低这些蛋白质的活性提高L-半胱氨酸 生产能力。

在本发明中，L-半胱氨酸生产菌优选具有对反馈抑制有抗性的突变型 SAT。作为衍生自大肠杆菌的且对反馈抑制有抗性的突变型SAT，具体已知 用谷氨酸残基取代第256位的甲硫氨酸的突变型SAT(日本特开平 11-155571号公报)、用异亮氨酸残基取代第256位的甲硫氨酸残基的突变型 SAT(Denk，D.and Boeck，A.，J.general Microbiol.，133，515-525 (1987))、在第97位氨基酸残基至第273位氨基酸残基的区域具有突变或者 缺失从第227位的氨基酸残基开始的C端区域的突变型SAT(国际专利公开 WO97/15673，美国专利6，218，168)、对应于野生型SAT第89至96位的 氨基酸序列含有一个或多个突变并且对L-半胱氨酸的反馈抑制脱敏的突变 型SAT(美国专利公开申请20050112731(A1))、SAT第95和96位的Val残 基和Asp残基分别用Arg残基和Pro残基取代的突变型SAT(突变型基因的 名称：cysE5，WO2005/007841)、在第167位的苏氨酸残基用丙氨酸残基取 代的突变(美国专利公开6，218，168，美国专利公开申请20050112731(A1))， 等等。

SAT基因不限于大肠杆菌的基因，而是可以使用编码具有SAT活性的 蛋白质的任何基因。例如，已知对L-半胱氨酸的反馈抑制脱敏的拟南芥 (Arabidopsis thaliana)的SAT同工酶，也可以使用编码该同工酶的基因(FEMS  Microbiol.Lett.，179，453-459(1999))。

通过在细菌中导入编码SAT的基因、特别是编码反馈抑制抗性的突变 型SAT的基因并使之表达，能够赋予或增强L-半胱氨酸生产能力。

此外，通过提高编码SAT等蛋白质的基因的拷贝数，能够提高这些蛋 白质的活性。

以L-半胱氨酸作为起始物质生物合成的γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、 胱硫醚、以及高半胱氨酸等化合物的生产能力，也可以通过增强目的化合物 的生物合成途径的酶活性，或者降低从该生物合成途径分支出来的途径的酶 或分解目的化合物的酶的活性来赋予或增强。

例如，γ-谷氨酰半胱氨酸生产能力可以通过γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活 性的增强和/或谷胱甘肽合成酶活性的降低来增强。此外，谷胱甘肽生产能 力可以通过γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性和/或谷胱甘肽合成酶活性的增强 来赋予或增强。此外，通过使用对谷胱甘肽的反馈抑制有抗性的突变型γ- 谷氨酰半胱氨酸合成酶，也可以增强γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽的生产能 力。关于谷胱甘肽的生产，在Li等的综述(Yin Li，Gongyuan Wei，Jian Chen. Appl Microbiol Biotechnol(2004)66：233-242)中有详细记载。

胱硫醚、高半胱氨酸是L-甲硫氨酸生物合成途径的中间体，为了增强这 些物质的生产能力，部分利用后述的增强L-甲硫氨酸的生产能力的方法是有 效的。作为增强胱硫醚生产能力的具体的方法，已知有使用甲硫氨酸营养缺 陷性突变株的方法(特愿2003-010654)、在发酵培养基中添加半胱氨酸(或其 生物合成原料)和/或高丝氨酸(或其生物合成原料)的方法(特开 2005-168422)。高半胱氨酸以胱硫醚作为前体，因而为了增强高半胱氨酸生 产能力，增强胱硫醚生产能力的上述方法也是有效的。

L-甲硫氨酸生产能力的赋予或增强、以及L-甲硫氨酸生产菌

生产L-甲硫氨酸的能力可以通过赋予L-苏氨酸营养缺陷性或正亮氨酸 抗性而赋予或提高(日本特开2000-139471号)。在大肠杆菌中，L-苏氨酸的 生物合成中涉及的酶的基因作为苏氨酸操纵子(thrABC)存在，并且丧失了L- 高丝氨酸生物和下述化合物合成能力的L-苏氨酸营养缺陷型菌株可以通过 例如缺失thrBC部分而获得。在正亮氨酸抗性菌株中，削弱了S-腺苷甲硫氨 酸合成酶活性，并且赋予或提高了生产L-甲硫氨酸的能力。在大肠杆菌中， S-腺苷甲硫氨酸合成酶是由metK基因编码的。生产L-甲硫氨酸的能力还可 以通过缺失甲硫氨酸阻抑物或通过提高L-甲硫氨酸生物合成中涉及的酶如 高丝氨酸转琥珀酰基酶、胱硫醚γ-合成酶和天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶 II的活性而赋予或提高(特开2000-139471)。在大肠杆菌中，甲硫氨酸阻抑物 是由metJ基因编码的，高丝氨酸转琥珀酰基酶是由metA基因编码的，胱硫 醚γ-合成酶是由metB基因编码的，天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II是由 metL基因编码的。此外，通过使用对L-甲硫氨酸的反馈抑制有抗性的突变 型高丝氨酸转琥珀酰基酶，还可以赋予或提高生产L-甲硫氨酸的能力(特开 2000-139471号、US20090029424)。由于经由L-半胱氨酸作为中间体生物合 成L-甲硫氨酸，生产L-甲硫氨酸的能力还可以通过提高生产L-半胱氨酸的 能力得以提高(特开2000-139471号，US20080311632)。因此，对于赋予或 提高生产L-甲硫氨酸的能力，赋予或增强生产L-半胱氨酸的能力也是有效 的。

L-甲硫氨酸生产菌和用于构建它们的亲本株的具体实例包括如下的大 肠杆菌，如AJ11539(NRRL B-12399)、AJ11540(NRRL B-12400)、AJ11541 (NRRL B-12401)、AJ11542(NRRL B-12402)(英国专利2075055)，对作为L- 甲硫氨酸类似物的正亮氨酸有抗性的218菌株(VKPM B-8125，俄罗斯专利 2209248)，和73菌株(VKPM B-8126，俄罗斯专利2215782)。此外，作为 L-甲硫氨酸生产菌或用于构建该菌的亲本株，也可以使用源自大肠杆菌 W3110的AJ13425(FERM P-16808，特开2000-139471号(US7611873))。 AJ13425是一种L-苏氨酸营养缺陷型菌株，其中缺失了甲硫氨酸阻抑物，削 弱了胞内S-腺苷甲硫氨酸合成酶活性，且提高了胞内高丝氨酸转琥珀酰基酶 活性、胱硫醚γ-合成酶活性和天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶II活性。 AJ13425已于平成10年5月14日保藏于通产省工业技术院生命工学工业技 术研究所(现名：产业技术综合研究所专利生物保藏中心，地址：邮政编码 305-8566茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6，日本)，并给予保藏号 FERM P-16808。

此外，以L-甲硫氨酸作为起始物质生物合成的S-腺苷甲硫氨酸等化合 物的生产能力，也可以通过增强目的化合物的生物合成途径的酶活性，或者 降低从该生物合成途径分支出来的途径的酶或分解目的化合物的酶的活性 来赋予或增强。例如，S-腺苷甲硫氨酸生产能力可以通过强化甲硫氨酸腺苷 转移酶(EP0647712、EP1457569)、强化分泌因子MdfA(US7410789)来赋予或 增强。

yeeE基因编码的蛋白质的活性的增强

本发明的细菌可以通过对诸如上述的具有生产含硫氨基酸的能力的属 于肠杆菌科的细菌进行修饰而增强yeeE基因编码的蛋白质(以下，也记作 “YeeE”或“YeeE蛋白质”)的活性来获得。而且，也可以在进行修饰而增强 YeeE蛋白质的活性后，再赋予或增强生产含硫氨基酸的能力。

“yeeE基因编码的蛋白质的活性增强”是指：yeeE基因编码的YeeE蛋 白质的活性相对于野生株或亲本株等非修饰株增强。蛋白质的活性与非修饰 株相比增强即可，没有特殊限制，与非修饰株相比优选增强1.5倍以上、更 优选2倍以上、更优选3倍以上。此外，“yeeE基因编码的蛋白质的活性增 强”不仅包括在原本具有YeeE蛋白质的活性的菌株中增强YeeE蛋白质的活 性，也包括在原本不存在YeeE蛋白质的活性的菌株中赋予YeeE蛋白质的 活性。即，例如，Pantoea ananatis不具有yeeE基因，也包括在Pantoea ananatis 中赋予YeeE蛋白质的活性。

增强YeeE蛋白质的活性这样的修饰可以通过例如增强yeeE基因的表达 来实现。

用于增强yeeE基因的表达的修饰可以通过例如，利用基因重组技术， 提高细胞中的基因的拷贝数来进行。例如，可以将含yeeE基因的DNA片段 与在宿主细菌中发挥功能的载体、优选多拷贝型载体连接，制作重组DNA， 并将其导入细菌，进行转化。作为所述载体，可以列举出可在宿主细菌的细 胞内自主复制的载体。作为可在大肠杆菌细胞内自主复制的载体，可以列举 出pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184(pHSG、 pACYC可从TAKARA Bio公司获得)、RSF1010、pBR322、pMW219(pMW219 可从NIPPON GENE公司获得)、pSTV29(可从TAKARA Bio公司获得)等。

将重组DNA导入细菌，可以按照已经报告的转化法来进行。例如也可 以应用，用氯化钙处理受体菌细胞来增加DNA的透过性的方法，该方法已 被报道用于大肠杆菌K-12(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53， 159(1970))，或者从处于增殖阶段的细胞制备感受态细胞并导入DNA的方 法，该方法已被报道用于枯草芽孢杆菌(Duncan，C.H.，Wilson，G.A.and  Young，F.E.，Gene，1，153(1977))。或者，还可以应用将DNA受体 菌的细胞制备成容易导入重组DNA的原生质体或原生质球的状态，再将重 组DNA导入DNA受体菌的方法，该方法已知用于枯草杆菌、放线菌类和 酵母(Chang，S.and Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)； Bibb，M.J.，Ward，J.M.and Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)； Hinnen，A.，Hicks，J.B.and Fink，G.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 75，1929(1978))。

另一方面，提高yeeE基因的拷贝数还可以通过使细菌的基因组DNA上 存在多个拷贝的yeeE基因来实现。为了将多个拷贝的yeeE基因导入到细菌 的基因组DNA上，可以利用基因组DNA上以多拷贝存在的序列作为靶标， 通过同源重组来进行。作为基因组DNA上以多拷贝存在的序列，可以利用 重复DNA(repetitive DNA)、存在于转座元件端部的反向重复序列。此外， 可以随机连接在基因组上存在的yeeE基因的近旁，也可以重复地插入到基 因组上的非必要的基因上。这些基因导入可以使用温度敏感型载体、或者使 用整合载体来实现。

或者，还可以如特开平2-109985号公报所公开的那样，将yeeE基因装 载在转座子中，使其发生转移，从而将多个拷贝导入基因组DNA中。基因 转移到了基因组上的事实，可以通过以yeeE基因的一部分为探针进行 Southren杂交来予以确认。

而且，yeeE基因的表达的增强除了上述的基因拷贝数的扩增以外，还 可以按照国际公开00/18935号小册子记载的方法，通过下述方法来实现： 将基因组DNA上或质粒上的yeeE基因的各启动子等表达调控序列更换为强 力的；使各基因的-35、-10区域接近共有序列；扩增使得yeeE基因的表达 提高的调节子，或缺失或弱化使得yeeE基因的表达降低的调节子。作为强 力的启动子，已知有例如，lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、 araBA启动子、λ噬菌体的PR启动子、PL启动子、tet启动子、T7启动子、 启动子等。此外，也可以使用大肠杆菌的苏氨酸操纵子的启动子。此外， 还可以在yeeE基因的启动子区域、SD区域导入碱基取代等，将其修饰成更 强力的。例如，也可以将SD区域的序列直接替换成启动子下游的SD 区域的序列。启动子强度的评价方法和强力启动子的例子记载于Goldstein 等的论文(Prokaryotic promoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1， 105-128(1995))等中。而且，已知核糖体结合位点(RBS)与起始密码子之间的 间隔、特别是起始密码子临近上游的序列中数个核苷酸的取代对mRNA的 翻译效率有非常大的影响，可以对其进行修饰来提高翻译效率。yeeE基因 的启动子等的表达调节区域也可以使用启动子检索载体、GENETYX等基因 解析软件来确定。通过这些启动子取代或修饰可以强化yeeE基因的表达。 表达调控序列的取代可以采用例如使用温度敏感型质粒的方法、Red驱动整 合法(WO2005/010175)。

使yeeE基因的表达量增大的修饰也可以通过例如，将yeeE基因的表达 正调节调控因子、负调控调控因子模块化来实现。例如，作为调控因子，可 以列举出属于LysR家族等的，可以利用数据库EcoCyc(http：//ecocyc.org/) 等来发现。通过调控因子的模块化可见yeeE基因的转录量的增大、YeeE蛋 白质的量的增大即可。

yeeE基因的表达增强的事实可以通过确认yeeE基因的转录量增大、或 确认YeeE蛋白质的量增大来确认。

yeeE基因的转录量增大的确认可以通过将从该基因转录的mRNA的量 与野生株、或者非修饰株相比较来进行。作为评价mRNA的量的方法，可 以列举出Northern杂交、RT-PCR等(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001))。mRNA的量优选与 非修饰株相比，增大至例如1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。

YeeE蛋白质的量增大的确认可以使用抗体通过蛋白质印迹“Western blotting”来进行(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold  spring Harbor(USA)，2001))。蛋白质的量优选与非修饰株相比，增大至例 如1.5倍以上、2倍以上、或3倍以上。

而且，对于上述的编码SAT等的基因，也可以采用同样的方法将重组 DNA导入细菌，此外，可以提高基因的拷贝数。

大肠杆菌K12MG1655株的yeeE基因相当于以GenBank登录号 NC_000913(VERSION NC_000913.2GI：49175990)登录NCBI数据库的基 因组序列中的2082491～2083549位的序列的互补序列。大肠杆菌K12 MG1655株的yeeE基因与ECK2007、JW1995同义。此外，大肠杆菌K12 MG1655株的YeeE蛋白质以GenBank登录号NP_416517(version  NP_416517.1GI：16129954、locus_tag=“b2013”)登录。所述MG1655株的 yeeE基因的碱基序列、以及编码该基因的氨基酸序列分别如SEQ ID NO： 13以及14所示。

由于yeeE基因的碱基序列会由于细菌所属的属、种或菌株而不同，所 以接受使YeeE蛋白质的活性增强的修饰的yeeE基因可以为SEQ ID NO： 13的碱基序列的变体。yeeE基因的变体可以通过使用BLAST(http： //blast.genome.jp/)等参照SEQ ID NO：13的碱基序列进行检索。此外，yeeE 基因的变体包括该基因的同源物，例如，可以使用例如微生物如属于肠杆菌 科的细菌、棒状杆菌型细菌的染色体作为模板，基于例如SEQ ID NO：13 的碱基序列制备的合成寡核苷酸通过PCR扩增的基因。

作为大肠杆菌以外的细菌的yeeE基因同源物的例子，可以列举出以下 的细菌的yeeE基因(表1)。表1中，同一性(%)是基于BLAST的大肠杆菌 K12株的YeeE蛋白质(SEQ ID NO：14)与各细菌的同源物之间的同一性。登 录号是NCBI数据库的登录号。

[表1]

表1

此外，yeeE基因是编码增强在细胞内的活性时生产含硫氨基酸的能力 提高的蛋白质即可，可以是编码具有在诸如上述的YeeE蛋白质的氨基酸序 列中1个或数个位置包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等的 序列的蛋白质的基因。尽管由术语“一个或数个”表示的数可能依赖于氨基酸 残基在蛋白质三维结构中的位置或者氨基酸残基的类型而有差异，但是具体 地，该数优选为1至20，更优选1至10，仍更优选1至5。上述一个或数 个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加为保持该蛋白质正常功能的保守突 变。保守突变通常为保守取代。保守取代是在Phe、Trp和Tyr之间互相发 生取代的突变，如果取代位点为芳族氨基酸的话；在Leu、Ile和Val之间互 相发生取代的突变，如果取代位点为疏水性氨基酸的话；在Gln和Asn之间 互相发生取代的突变，如果取代位点为极性氨基酸的话；在Lys、Arg和His 之间互相发生取代的突变，如果取代位点为碱性氨基酸的话；在Asp和Glu 之间互相发生取代的突变，如果取代位点为酸性氨基酸的话；以及在Ser和 Thr之间互相发生取代的突变，如果取代位点为具有羟基的氨基酸的话。保 守取代的具体实例包括：Ser或Thr取代Ala；Gln、His或Lys取代Arg； Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；Asn、Glu或Gln取代Asp；Ser或 Ala取代Cys；Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；Gly、Asn、Gln、 Lys或Asp取代Glu；Pro取代Gly；Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His； Leu、Met、Val或Phe取代Ile；Ile、Met、Val或Phe取代Leu；Asn、Glu、 Gln、His或Arg取代Lys；Ile、Leu、Val或Phe取代Met；Trp、Tyr、Met、 Ile或Leu取代Phe；Thr或Ala取代Ser；Ser或Ala取代Thr；Phe或Tyr 取代Trp；His、Phe或Trp取代Tyr；以及Met、Ile或Leu取代Val。上述 氨基酸取代、缺失、插入、添加、倒置等可以为由于所述基因自其衍生的细 菌的个体差异、种差异等引起的天然存在的突变(mutant或variant)所致的结 果。

而且，具有诸如上述的保守突变的基因可以是编码相对于诸如上述的 YeeE蛋白质的氨基酸序列整体，具有80%以上、优选90%以上、更优选95% 以上、更优选97%以上、特别优选99%以上的同源性，且增强在细胞内的活 性时生产含硫氨基酸的能力提高的蛋白质的基因。而且，在本说明书中，“同 源性”(homology)有时指“同一性”(identity)。

此外，yeeE基因可以为能够与可以从已知基因序列制备的探针、例如 SEQ ID NO：13所示的碱基序列的互补序列在严格条件下杂交，并且编码具 有等同于YeeE蛋白的功能的蛋白质的DNA。所述“严格条件”是指形成所谓 的特异性杂合体并且不形成非特异性杂合体的条件。严格条件的实例包括如 下的条件，在该条件下，高度同源的DNA彼此杂交，例如，不低于80%同 源的、优选不低于90%同源的、更优选不低于95%同源的、仍更优选不低于 97%同源的、特别优选不低于99%同源的DNA彼此杂交，并且同源性比上 述低的DNA彼此不杂交，或者典型Southern杂交的洗涤条件，即，在对应 于1x SSC，0.1%SDS在60°C、优选0.1x SSC，0.1%SDS在60°C、更优 选0.1x SSC，0.1%SDS在68°C的盐浓度和温度下洗涤1次、优选2或3 次的条件。

探针可以为与基因互补的序列的一部分。这种探针可以使用基于已知的 基因序列制备的寡核苷酸作为引物和含有该碱基序列的DNA片段作为模板 通过PCR制备。例如，当使用长度约300bp的DNA片段作为探针时，杂 交的洗涤条件可以为例如50°C，2x SSC和0.1%SDS。

上述的关于基因、蛋白质的变体的记载也可适用于丝氨酸乙酰转移酶、 3-磷酸甘油酸脱氢酶等酶、或YdeD蛋白质、以及编码它们的基因。

而且，在大肠杆菌染色体上，yeeE基因的下游存在yeeD基因，可以认 为两基因形成了操纵子(数据库“EcoCys”；http：//ecocyc.org/、数据库 “RegulonDB”；http：//regulondb.ccg.unam.mx/)。通常，很多情况下，形成 了操纵子的基因群担负着共同功能或关联功能。因此，在使得YeeE蛋白质 的活性增强的修饰发挥某种效果的情况下，使得YeeD蛋白质的活性增强的 修饰也存在发挥同样效果的可能性。在本发明中，可以与使YeeE蛋白质的 活性增强的修饰一起，进行使YeeD蛋白质的活性增强的修饰。

<2>本发明的含硫氨基酸、或其关联物质、或它们的混合物的制造方法

通过将如上述得到的本发明的细菌在培养基中进行培养，并从该培养基 收集含硫氨基酸、或其关联物质、或它们的混合物，能够制造这些化合物。 在含硫氨基酸为L-半胱氨酸的情况下，作为L-半胱氨酸的关联物质，可以 列举出前述的S-磺酸半胱氨酸、噻唑烷衍生物、对应于该噻唑烷衍生物的硫 代半酮缩醇等。在含硫氨基酸为L-甲硫氨酸的情况下，作为L-甲硫氨酸的 关联物质，可以列举出前述的S-腺苷甲硫氨酸等。

作为待使用的培养基，可以提到含有碳源、氮源、硫源、无机离子和视 需要的其他有机成分的常规培养基。

作为碳源，可以使用糖类如葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜和淀粉水解产物， 和有机酸如富马酸、柠檬酸和琥珀酸。

作为氮源，可以列举出例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐，大豆 水解物等有机氮，氨气，氨水。

作为硫源，可以列举出例如无机硫化合物如硫酸盐、亚硫酸盐、硫化物、 次硫酸盐和硫代硫酸盐。

作为有机痕量营养物，有利的是以合适量添加所需物质如维生素B1、 酵母提取物等。除此之外，可以视需要少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、 锰离子等。

培养优选在需氧条件下进行30至90小时，培养温度控制为25°C至 37°C，且培养中pH值控制为5至8。为了调节pH值，可以使用无机或有 机的酸性或碱性物质、氨气等。从培养液中收集含硫氨基酸可以通过常规离 子交换树脂方法、沉淀法以及其他已知方法的组合来实施。

如上述得到的L-半胱氨酸可以用于L-半胱氨酸衍生物的制造。作为L- 半胱氨酸衍生物，可以列举出半胱氨酸甲酯、半胱氨酸乙酯、羧甲司坦、磺 酸半胱氨酸、乙酰基半胱氨酸等。

此外，当L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物在培养基中累积时，L-半胱氨酸可 以通过从培养基中收集噻唑烷衍生物并使噻唑烷衍生物与L-半胱氨酸之间 的反应平衡向L-半胱氨酸方向移动来生产。此外，当S-磺酸半胱氨酸在培 养基中累积时，其可以通过使用还原剂如二硫苏糖醇进行还原而转化成L- 半胱氨酸。

实施例

以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。

(1)L-半胱氨酸生产菌的构建

将pACYC-DES导入大肠杆菌MG1655株以及Pantoea ananatis SC17 株，构建了L-半胱氨酸生产菌MG1655/pACYC-DES、以及 SC17/pACYC-DES，其中，pACYC-DES是将编码L-半胱氨酸的反馈抑制降 低的突变型丝氨酸乙酰转移酶的突变型cysE(US20050112731(A1))、编码L- 半胱氨酸分泌因子的ydeD基因(US5972663A)、以及编码L-丝氨酸的反馈抑 制降低的3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变型serA基因(US6180373)装载在1个质 粒上而得到的。所述突变型丝氨酸乙酰转移酶中，167位的苏氨酸残基被取 代成丙氨酸残基。此外，所述3-磷酸甘油酸脱氢酶中，410位的酪氨酸残基 缺失。pACYC-DES的构建记载于日本特开 2005-137369(US20050124049(A1)、EP1528108(A1))。

(2)yeeE基因表达用质粒pMIV-Pnlp8-yeeE(Ec)的构建

按以下流程构建了yeeE基因过表达用质粒pMIV-Pnlp8-yeeE(Ec)，其用 于增强YeeE蛋白质的活性。

(2-1)质粒pMIV-Pnlp0-YeaS3的构建

以大肠杆菌MG1655(ATCC47076)的染色体DNA作为模板，使用引物 P1(agctgagtcgacccccaggaaaaattggttaataac：SEQ ID NO：1)、以及引物 P2(agctgagcatgcttccaactgcgctaatgacgc：SEQ ID NO：2)作为引物进行PCR，获 得了包含nlpD基因的启动子区域(Pnlp0)约300bp的DNA片段。这些引物的 5'末端分别设计了限制酶SalI以及PaeI的位点。PCR循环如下：95℃3分 后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒进行2个循环，94℃20秒、55 ℃20秒、72℃15秒进行25个循环，最后72℃5分。将所得片段用SalI 以及PaeI消化，插入pMIV-5JS(日本特开2008-99668)的SalI-PaeI位点，得 到了质粒pMIV-Pnlp0。该pMIV-Pnlp0质粒中插入的Pnlp0启动子的PaeI-SalI 片段的碱基序列如SEQ ID NO：3所示。

然后，以MG1655的染色体DNA作为模板，使用引物 P3(agctgatctagaaaacagaatttgcctggcggc：SEQ ID NO：4)、以及引物 P4(agctgaggatccaggaagagtttgtagaaacgc：SEQ ID NO：5)作为引物，进行PCR， 获得了包含rrnB基因的终止子区域约300bp的DNA片段。这些引物的5' 末端分别设计了限制酶XbaI以及BamHI的位点。PCR循环如下进行：95 ℃3分后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40秒进行2个循环，94℃20 秒、59℃20秒、72℃15秒进行25个循环，最后72℃5分。将所得片段 用XbaI以及BamHI消化，插入pMIV-Pnlp0的XbaI-BamHI位点，获得了 质粒pMIV-Pnlp0-ter。

然后，以MG1655的染色体DNA作为模板，使用引物 P5(agctgagtcgacgtgttcgctgaatacggggt：SEQ ID NO：6)、以及引物 P6(agctgatctagagaaagcatcaggattgcagc：SEQ ID NO：7)作为引物进行PCR，获 得了含yeaS基因的约700bp的DNA片段。这些引物的5'末端分别设计了限 制酶SalI以及XbaI的位点。PCR循环如下进行：95℃3分后，95℃60秒、 50℃30秒、72℃40秒进行2个循环，94℃20秒、55℃20秒、72℃15 秒进行25个循环，最后72℃5分。将所得片段用SalI以及XbaI进行消化， 插入pMIV-Pnlp0-ter的SalI-XbaI位点，获得了质粒pMIV-Pnlp0-YeaS3。这 样，构建了pMIV-5JS载体上nlpD启动子、yeaS基因、以及rrnB终止子依 次连接的yeaS的表达单元。

(2-2)质粒pMIV-Pnlp8-YeaS3的构建

为了通过对nlpD启动子的-10区域进行修饰，成为更强力的启动子，采 用以下方法进行了-10区域的随机化。nlpD启动子区域(图1)中存在2个推 定作为启动子发挥功能的区域，它们各自-10区域以及-35区域表示为P1(-10) 和P1(-35)、以及P2(-10)和P2(-35)。以质粒pMIV-Pnlp0作为模板，使用引 物P1以及引物 P7(atcgtgaagatcttttccagtgttnannagggtgccttgcacggtnatnangtcactgg：SEQ ID NO： 8)作为引物进行PCR，获得了将nlpD启动子的3'末端侧所含得到-10区域 (P1(-10))随机化而成的DNA片段。PCR循环如下进行：95℃3分后，95℃ 60秒、50℃30秒、72℃40秒进行2个循环，94℃20秒、60℃20秒、 72℃15秒进行25个循环，最后72℃5分。

另一方面，同样以质粒pMIV-Pnlp0作为模板，使用引物P2以及引物 P8(tggaaaagatcttcannnnncgctgacctgcg：SEQ ID NO：9)作为引物进行PCR，获 得了将nlpD启动子的5'末端侧所含的-10区域(P2(-10))随机化而成的DNA 片段。PCR循环如下进行：95℃3分后，95℃60秒、50℃30秒、72℃40 秒进行2个循环，94℃20秒、60℃20秒、72℃15秒进行25个循环，最 后72℃5分。

所得3'末端侧与5'末端侧的片段能够通过引物P7与P8中设计的BglII 位点而连接，能够构建完整的2个位置的-10区域随机化的nlpD启动子。以 该片段作为模板，使用P1以及P2作为引物进行PCR，获得了完整的修饰 型nlpD启动子的DNA片段。PCR循环如下进行：95℃3分后，95℃60 秒、50℃30秒、72℃40秒进行2个循环，94℃20秒、60℃20秒、72 ℃15秒进行12个循环，最后72℃5分。

将扩增片段用引物的5'末端设计的限制酶SalI以及PaeI消化，插入同 样用SalI以及PaeI消化的质粒pMIV-Pnlp0-YeaS3，从而将质粒上的野生型 nlpD启动子部位(Pnlp0取代为突变型Pnlp。从中选择带有SEQ ID NO：10 所示的启动子序列(Pnlp8)的，命名为pMIV-Pnlp8-YeaS7。该质粒中插入的 Pnlp8启动子的PaeI-SalI片段的碱基序列如SEQ ID NO：10所示。Pnlp8启 动子是比Pnlp0启动子更强力的启动子。

(2-3)yeeE基因表达用质粒pMIV-Pnlp8-yeeE(Ec)的构建

通过将整合到前述的表达质粒pMIV-Pnlp8-YeaS7中的yeaS基因取代成 yeeE基因，构建了在pMIV-5JS载体上装载了Pnlp8启动子、yeeE基因、以 及rrnB终止子依次连接而成的yeeE表达单元而得到的质粒。yeeE基因的过 表达用质粒pMIV-Pnlp8-yeeE(Ec)的构建方法如下所示。

大肠杆菌的yeeE基因的扩增如下进行：以MG1655株基因组DNA作 为模板，使用yeeE(Ec)SalI-F(acgcgtcgacatgttttcaatgatattaagcgggc：SEQ ID NO： 11)、yeeE(Ec)XbaI-R(ctagtctagattaatttgccgcagcagttgcc：SEQ ID NO：12)作为 引物，PCR循环(94℃5分后，98℃5秒、55℃5秒、72℃90秒进行30 个循环，最后4℃保温)。引物的两端分别设计了SalI和XbaI位点。将扩增 片段用SalI与XbaI切割，插入同样用SalI与XbaI切割的pMIV-Pnlp8-YeaS7， 制作了pMIV-Pnlp8-yeeE(Ec)。此外，作为对应的空载体(对照用)，使用了 pMIV-5JS(特开2008-99668)。而且，yeeE基因的DNA序列如SEQ ID NO： 13所示，yeeE基因产物的预想氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

(3)L-半胱氨酸生产培养(大肠杆菌)

为了考察yeeE基因的过表达对L-半胱氨酸以及L-半胱氨酸关联化合物 的发酵生产的效果，进行了导入了前述的L-半胱氨酸生产菌大肠杆菌 MG1655/pACYC-DESにyeeE过表达质粒pMIV-Pnlp8-yeeE(Ec)及其对照用 的空载体pMIV-5JS的株的发酵生产培养，比较了L-半胱氨酸以及L-半胱氨 酸关联化合物的生产量。培养中使用了下述组成的L-半胱氨酸生产培养基。

〔L-半胱氨酸生产培养基〕(各成分的浓度为最终浓度)

对于各成分，预先分别制作100/47.5倍(成分1)、100/47.5倍(成分2)、 50倍(成分3)、1000倍(成分4)的保存液溶液，使用时混合，用灭菌水调整 为规定的量，制备成最终浓度。灭菌如下进行：110℃、30分高压灭菌(成分 1、2)，180℃、5小时以上的干热灭菌(成分5)，过滤灭菌(成分3、4)。

L-半胱氨酸生产培养按以下顺序进行。将各L-半胱氨酸生产菌涂布于 LB琼脂培养基，37℃前培养过夜后，用10微升大小的接种环(NUNC公司 Blue Loop)刮取平板上约7cm的菌体3次(3环)，接菌至装入大试管(内径 23mm、长度20cm)中的2ml上述L-半胱氨酸生产培养基中，制备使得培养 开始时间点的菌体量基本相同。32℃振荡培养，30小时后结束培养。培养 基中生产的L-半胱氨酸(含胱氨酸等部分L-半胱氨酸关联物质)的定量采用 Gaitonde，M.K.(Biochem J.1967Aug；104(2)：627-33.)所述的方法进行。 对于各株，均进行4组平行实验，此时的L-半胱氨酸生产量(平均值)、标准 偏差、及相对于消耗葡萄糖的L-半胱氨酸收率如表2所示。通过yeeE基因 的过表达，L-半胱氨酸的蓄积浓度增大。因此可知，通过增强YeeE蛋白质 的活性，提高了L-半胱氨酸的生产。

[表2]

表2大肠杆菌中yeeE基因的过表达对L-半胱氨酸生产的效果

质粒 L-半胱氨酸(g/L) 相对消耗糖的收率(%) pMIV-5JS 0.65±0.04 1.95 pMIV-Pnlp8-yeeE(Ec) 1.86±0.06 4.65

(4)L-半胱氨酸生产培养(Pantoea ananatis)

为了考察yeeE基因过表达对L-半胱氨酸以及L-半胱氨酸关联化合物的 发酵生产的效果，进行了在前述的L-半胱氨酸生产菌Pantoea ananatis  SC17/pACYC-DES中导入了yeeE过表达质粒pMIV-Pnlp8-yeeE(Ec)及其对照 用空载体pMIV-5JS的株的发酵生产培养，比较了L-半胱氨酸以及L-半胱氨 酸关联化合物的生产量。L-半胱氨酸生产培养以及L-半胱氨酸的定量方法与 前述的大肠杆菌的实施例基本相同。但，接菌量为1环，培养时间为22小 时。对于各株，均进行4组平行实验，此时的L-半胱氨酸生产量(平均值)、 标准偏差、及相对于消耗葡萄糖的L-半胱氨酸收率如表3所示。通过yeeE 基因的过表达，L-半胱氨酸的蓄积浓度增大。因此可知，通过增强YeeE蛋 白质的活性，提高了L-半胱氨酸的生产。

[表3]

表3Pantoea ananatis中yeeE基因的过表达对L-半胱氨酸生产的效果

质粒 L-半胱氨酸(g/L) 相对消耗糖的收率(%) pMIV-5JS 0.27±0.04 0.67 pMIV-Pnlp8-yeeE(Ec) 0.41±0.04 1.03

工业实用性

根据本发明，能够提高细菌的生产含硫氨基酸的能力，能够高效率地制 造含硫氨基酸或其关联物质、或它们的混合物。

序列表说明

SEQ ID NO：1：Pnlp0扩增用引物

SEQ ID NO：2：Pnlp0扩增用引物

SEQ ID NO：3：Pnlp0的碱基序列

SEQ ID NO：4：rrnB基因的终止子区域扩增用引物

SEQ ID NO：5：rrnB基因的终止子区域扩增用引物

SEQ ID NO：6：yeaS基因扩增用引物

SEQ ID NO：7：yeaS基因扩增用引物

SEQ ID NO：8：Pnlp0的-10区域(3’侧)随机化引物

SEQ ID NO：9：Pnlp0的-10区域(5’侧)随机化引物

SEQ ID NO：10：Pnlp8的碱基序列

SEQ ID NO：11：yeeE基因扩增用引物

SEQ ID NO：12：yeeE基因扩增用引物

SEQ ID NO：13：大肠杆菌野生型yeeE基因的碱基序列

SEQ ID NO：14：大肠杆菌野生型YeeE蛋白质的氨基酸序列

SEQ ID NO：15：含与yeaS基因的连接位点的Pnlp0的碱基序列

SEQ ID NO：16：含与yeaS基因的连接位点的Pnlp8的碱基序列

PCT/RO/134表