一种增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法

摘要

本发明公开一种增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，是将可同时过量表达酪氨酸转氨酶TyrB、甲基紫罗碱外转运蛋白YddG、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶AroG、分支酸变位酶和预苯酸脱水酶PheA、莽草酸激酶AroK以及莽草酸脱氢酶YdiB的重组质粒转化宿主大肠杆菌，并通过液体发酵生产L-苯丙氨酸，所述重组质粒是将大肠杆菌来源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB编码基因进行人工修饰以解除其所受代谢调控，并插入载体构建而成。本发明可明显增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸产量高，有害副产物乙酸浓度低，发酵成本低廉，工艺简单，适宜产业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种通过基因工程技术和发酵的 手段增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法。

背景技术

L-苯丙氨酸（L-phenylalanine）是一种人体必需但自身无法合成的具有生理 活性的芳香族氨基酸，也是一种重要的医药和食用化学品中间体，在医药行业 主要用于生产抗肿瘤药物和氨基酸输液制剂，在食品行业主要用于合成二肽甜 味剂阿斯巴甜，具有良好的应用前景。生产L-苯丙氨酸的方法主要有水解抽提 法、化学合成法、酶法和发酵法四种，其中，微生物发酵法所利用原料廉价易 得，又可在常温常压下进行，是目前国内外生产L-苯丙氨酸的主流方法。L-苯 丙氨酸在大肠杆菌细胞内通过芳香族氨基酸合成代谢途径合成：葡萄糖进入细 胞后经过糖酵解途径和磷酸戊糖途径合成磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸-赤藓糖， 在3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶（AroG）的作用下进入莽草酸途径， 在莽草酸激酶（AroK）、莽草酸脱氢酶（YdiB）等酶类的作用下合成分支酸， 之后经分支酸变位元酶和预苯酸脱水酶（PheA）等酶作用生成芳香族氨基酸前 体物，再经过酪氨酸转氨酶（TyrB）的作用合成L-苯丙氨酸。

从自然界中筛选出的具有产酸能力的微生物菌株一般氨基酸积累量有限； 通过特别修饰选育出的突变株虽可提高L-苯丙氨酸的生产效率，但其盲目性大， 工作量繁重，生产成本高，且突变株一般携带有营养缺陷，产量进一步提高受 到限制。通过基因克隆手段解除代谢调控位点以促进目的产物合成已成功应用 于柠檬酸、乳酸、琥珀酸等多种代谢产物的发酵生产，是L-苯丙氨酸工业化生 产的必然趋势，但是，L-苯丙氨酸的代谢调控受限于基因转录起始、转录过程、 翻译起始、翻译过程、酶量、酶活等多水平、不同层次的反馈控制，且由于质 粒载体的大小受到限制，很难通过过量表达连续的多个基因来解除所有的调控 位点，此外，大肠杆菌在发酵过程中会积累副产物——乙酸，其可限制菌体的 生长及目的产物的合成，降低产率。总之，可高产L-苯丙氨酸且发酵成本低廉 的基因工程菌株目前尚未见报道，难以形成产业化。

发明内容

针对现有技术存在的上述缺陷，本发明的目的在于提供一种增强大肠杆菌 L-苯丙氨酸胞外分泌的方法。本发明可明显增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌 水平，L-苯丙氨酸产量高，有害副产物乙酸浓度低，发酵成本低廉，工艺简单， 适宜产业化生产。

本发明的技术方案如下：

一种增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌的方法，是将可同时过量表达酪氨 酸转氨酶TyrB、甲基紫罗碱外转运蛋白YddG、3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7- 磷酸合成酶AroG、分支酸变位酶和预苯酸脱水酶PheA、莽草酸激酶AroK以 及莽草酸脱氢酶YdiB的重组质粒转化宿主大肠杆菌，并通过液体发酵生产L- 苯丙氨酸。

其进一步的技术方案为：

所述重组质粒是将大肠杆菌来源的TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以 及YdiB编码基因进行人工修饰以解除其所受代谢调控，并插入载体构建而成；

所述液体发酵条件控制如下：发酵培养基的起始葡萄糖浓度为3～15g/L， 发酵过程中的葡萄糖浓度为1～4g/L；发酵温度35～42℃，发酵pH值6.5～7.5， 通气量0.5～1.0vvm，溶氧量为初始氧浓度的10～35%，发酵时间48～72h。

所述TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB编码基因的天然启动 子被其它不受末端代谢产物反馈阻遏的强启动子所替换，以增强其表达水平。

所述TyrB编码基因编码框的起始碱基序列被SEQ ID NO:1所示的碱基序 列替换，以解除其与阻遏蛋白TyrR的结合能力。

所述AroG氨基酸序列中第146位的天门冬氨酸被替换成天门冬酰胺，以 解除苯丙氨酸对其的反馈抑制。

所述PheA的R-domain结构域被删除，以解除苯丙氨酸对其的反馈抑制。

所述强启动子包括P_R和/或P_L启动子

本发明的有益技术效果如下：

本发明运用基因工程手段将大肠杆菌来源的TyrB、YddG、AroG、PheA、 AroK以及YdiB编码基因进行人工修饰，如引入强启动子、删除结构域、碱基 替换、氨基酸突变等，使上述基因所受的代谢调控得到解除，再插入载体成功 构建得到可同时过量表达TyrB、YddG、AroG、PheA、AroK以及YdiB的表 达质粒，转化该质粒的宿主大肠杆菌可高产L-苯丙氨酸；其中，通过增强L- 苯丙氨酸合成代谢通路所需酶类（AroG、PheA、AroK、YdiB以及TyrB）的 表达水平，可加快L-苯丙氨酸的合成速率，同时，YddG的表达增强可加快L- 苯丙氨酸的胞外转运速率，降低胞内浓度，从而降低L-苯丙氨酸对代谢合成途 径产生的反馈抑制，最终达到提高其代谢通量和发酵强度的目的；本发明方法 可明显增强大肠杆菌L-苯丙氨酸胞外分泌水平，L-苯丙氨酸产量高（可达 62g/L），有害副产物乙酸浓度低（≤3g/L），发酵成本低廉，工艺简单，适宜 产业化生产。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行具体说明。

以下实施例所涉及试验材料如下：

大肠杆菌拟合DNA提取自大肠杆菌Escherichia coli str.K-12 substr. W3110（购自美国模式菌种收集中心ATCC，保藏编号为ATCC NO:27325）； pMD 18T-simple Vector购自宝生物工程（大连）有限公司；限制性内切酶EcoR Ⅰ、EcoRV、AflⅡ、Nco I、Kpn I，DNA聚合酶，连接酶均购自赛默飞公司； 质粒pSY130-14（包含P_R和P_L启动子）由本发明人实验室保藏，其构建方法 可参照如下文献报道：S Sugimoto,M Yabuta,N Kato,T Seki,T Yoshida,H  Taguchi(1987)Hyperproduction of phenylalanine by Escherichia coli:application  of a temperature-controllable expression vector carrying the repressor-promoter  system of bacteriophage lambda.Journal of Biotechnology.5:237–253；RNAprep  Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒（离心柱型含DNAase）购自天根生化 科技有限公司；PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time购自宝生物工程 （大连）有限公司。

其它原料和试剂为市售国产或进口分析纯商品。

所使用仪器设备均为本领域常规仪器设备。

以下实施例所用种子培养基为LB培养基，其组成为：蛋白胨10g/L，酵 母粉5g/L，氯化钠10g/L，其余成分为水；所用液体发酵培养基组成为： K₂HPO₄·3H₂O 13.57g/L，KH₂PO₄ 4.5g/L，(NH)₄SO₂ 1g/L，MgSO₄ 1g/L，arginine 0.1g/L，histidine 0.1g/L，isolecine 0.1g/L，valine 0.1g/L，proline 0.2g/L， p-aminobenzoic acid 0.02g/L，p-hydroxybenzoic0.02g/L，CaCl₂ 0.015g/L，VB₁0.075g/L，FeSO₄·7H₂O 0.1175g/L，Na-Citrate 0.1g/L，微量元素溶液1.5ml/L， 其余成分为水（微量元素溶液组成为：Al₂(SO₄)₃·18H₂O 2g/L，CoSO₄·7H₂O 0.75 g/L，CuSO₄·5H₂O 2.5g/L，H₃BO₃ 0.5g/L，MnSO₄·7H₂O 24g/L，Na₂MoO₄·2H₂O 3g/L，NiSO₄·6H₂O 2.5g/L，ZnSO₄·7H₂O 15g/L，其余成分为水）。

实施例1构建过量表达AroG、PheA、AroK以及YdiB的质粒pR15ABK

1.1 3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶AroG代谢调控的解除

以大肠杆菌拟合DNA为模板，用上游引物aroG15_F146（碱基序列如SEQ  ID NO:2所示）和下游引物aroG_HindⅢ_RV（碱基序列如SEQ ID NO:3所示） 进行PCR扩增获得基因片段A，以大肠杆菌拟核DNA为模板，用上游引物 aroG_Kpn Ⅰ_FW（碱基序列如SEQ ID NO:4所示）和下游引物aroG15_R146（碱 基序列如SEQ ID NO:5所示）进行PCR扩增获得基因片段B。

以基因片段A和B为模板，通过重叠PCR（按照PCR定点突变技术进行， 参考文献如下：Ho,S.N.,H.D.Hunt,R.M.Horton,J.K.Pullen,and L.R.Pease(1989) Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene.77:51-59）扩增目的片段，引物设计如下：上游引物aroG_SmaⅠ_FW碱 基序列如SEQ ID NO:6所示，下游引物aroG_AflⅡ_EcoR Ⅰ_RV碱基序列如SEQ  ID NO:7所示，经上海生工生物工程有限公司测序，确定该片段AroG15基因编 码的AroG第146位天门冬氨酸被替换为天门冬酰胺。

通过酶切连接反应将上述扩增片段连接到质粒pSY130-14上，具体方法参 见相应限制性内切酶或连接酶说明书，构建得到质粒pR15，该质粒解除了苯丙 氨酸对AroG基因的代谢调控，通过强启动子P_R启动AroG表达。

1.2 分支酸变位酶和预苯酸脱水酶PheA代谢调控的解除

以大肠杆菌拟合DNA为模板扩增PheA基因催化活性中心第1～900bp碱基 序列，删除负责反馈抑制的R-domain结构域，引物设计如下：上游引物pheA_Sma Ⅰ_FW碱基序列如SEQ ID NO:8所示，下游引物碱基序列pheA_NcoⅠ_BamH Ⅰ_EcoRⅤ_RV如SEQ ID NO:9所示；通过酶切连接反应将该扩增片段连接到 上述质粒pR15，具体方法参见相应限制性内切酶或连接酶说明书，构建得到质 粒pR15A，该质粒解除了苯丙氨酸对AroG和PheA基因的代谢调控，通过强启 动子P_R启动AroG表达，通过强启动子P_L启动PheA表达。

1.3莽草酸激酶AroK和莽草酸脱氢酶YdiB代谢调控的解除

通过重叠PCR（方法同1.1）将AroK和YdiB编码基因连接在一起，引物 设计如下：第一对，上游引物ydiB_SmaⅠ_FW碱基序列如SEQ ID NO:10所示， 下游引物ydiB_aroK_RV碱基序列如SEQ ID NO:11所示，第二对，上游引物 aroK_ydiB_FV碱基序列如SEQ ID NO:12所示，下游引物aroK_SmaⅠ_RV碱基 序列如SEQ ID NO:13所示；通过酶切连接反应将该扩增片段连接到上述质粒 pR15A，位于PheA编码基因后，具体方法参见相应限制性内切酶或连接酶说明 书，构建得到质粒pR15ABK，该质粒解除了AroG、PheA、AroK以及YdiB基 因所受的代谢调控，并且使上述基因的天然启动子被P_R和P_L启动子所替换，通 过强启动子P_R启动AroG表达，通过强启动子P_L启动PheA、AroK以及YdiB 的表达。

实施例2 酪氨酸转氨酶TyrB代谢调控的解除

以大肠杆菌拟合DNA为模板进行PCR扩增获得tyrB编码基因，引物设计 如下：上游引物tyrB_EcoRV_SD_SB_FW碱基序列如SEQ ID NO:14所示，下游 引物tyrB_AflⅡ_EcoRⅠ_RV碱基序列如SEQ ID NO:15所示，其中，SD序列 AAGGAGGAACAGAC为核糖体结合位点，SB序列 ATGTTCCAGAAGGTCGATG（如SEQ ID NO:1所示）为替换后的tyrB基因编 码框起始碱基序列。

将扩增获得TyrB编码基因与pMD 18T-simple Vector连接，经上海生工生物 工程有限公司测序并鉴定正确后，通过酶切连接反应（具体方法参见相应限制 性内切酶或连接酶说明书）与实施例1构建的质粒pR15ABK连接，将tyrB编 码基因置于强启动子P_R后方，从而构建得到可同时过量表达TyrB、AroG、PheA、 AroK以及YdiB的质粒，通过强启动子P_R启动AroG和tyrB表达，通过强启动 子P_L启动PheA、AroK以及YdiB的表达；按照《分子克隆实验指南》所述操 作步骤转化大肠杆菌Escherichia coli str.K-12 substr.W3110进行液体发酵，发酵 结束，测得发酵液中L-苯丙氨酸浓度为45g/L，乙酸浓度为2.2g/L。

上述液体发酵生产方法具体如下：

种子培养：取菌株接种于LB培养基，于33℃振荡培养12h，摇床转速 200rpm，得到活化种子液。

液体发酵培养：用高浓度葡萄糖液调整液体发酵培养基的葡萄糖浓度为 15g/L，用浓氨水调整pH值至6.5～7.5，并调整通气量为0.5vvm，发酵温度为 35℃，以体积百分比5%的接种量接种上述活化种子液，当菌体OD₆₀₀=3.0时， 调整发酵温度为42℃，通气量为0.8vvm，改变搅拌转速控制溶氧量为初始氧 浓度的10～35%，通过流加高浓度葡萄糖液控制培养基葡萄糖浓度为4g/L，并 通过流加浓氨水控制pH值为6.5～7.5，发酵48h。

上述L-苯丙氨酸浓度测定方法：采用C18反向色谱柱，以7%甲醇为流动 相，检测波长210nm。

上述乙酸浓度测定方法：采用Shodex SH1011离子交换色谱柱在50℃的 温度下，以0.01mol/L的稀硫酸为流动相，流速0.8ml/min，利用示差检测器进 行监测。

实施例3 甲基紫罗碱外转运蛋白(methyl viologen efflux pump，YddG)代谢 调控的解除

以大肠杆菌拟合DNA为模板进行PCR扩增获得yddG编码基因，引物设 计如下：上游引物yddG_EcoRV_SD_FW碱基序列如SEQ ID NO:16所示，下 游引物yddG_NcoI_KpnI_RV碱基序列如SEQ ID NO:17所示，其中，SD序列 AAGGAGGAACAGAC为核糖体结合位点。

将扩增获得的yddG编码基因与pMD 18T-simple Vector连接，经上海生工生 物工程有限公司测序并鉴定正确后，通过酶切连接反应（具体方法参见相应限 制性内切酶或连接酶说明书）与实施例2构建的质粒连接，将yddG编码基因置 于强启动子P_L后方，构建得到可同时过量表达YddG、TyrB、AroG、PheA、AroK 以及YdiB的的重组表达质粒，通过强启动子P_R启动AroG和tyrB表达，通过 强启动子P_L启动PheA、AroK、YdiB以及YddG的表达。

按照《分子克隆实验指南》所述操作步骤转化大肠杆菌Escherichia coli str. K-12 substr.W3110，构建得到增强型L-苯丙氨酸生产菌株E.coli W14，以E.coli W14作为发酵菌株，按照实施例2所述方法进行液体发酵，发酵结束，测得发 酵液中L-苯丙氨酸浓度为55g/L，乙酸浓度为3g/L，测定方法同实施例1。

实施例4 TyrB和YddG过量表达的荧光定量PCR验证

取E.coli W14和E.coli W3110(含转化质粒pR15ABK的大肠杆菌 Escherichia coli str.K-12substr.W3110)分别接种于LB培养基，于33℃过夜振荡 培养，然后以体积百分比5%的接种量接种至液体发酵培养基（补加终浓度为5 g/L的葡萄糖），于35℃振荡培养9h，再转为38℃培养，并于培养第11h和第 15h取样，采用RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒（离心柱型含 DNAase）提取总RNA，具体操作步骤参见试剂盒使用说明书，并采用PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time在CFX96 Bio-Rad Real-Time PCR Detection  System（Bio-Rad）进行荧光定量PCR，以ihfB作为内参基因，以E.coli W3110 作为对照菌株，于CFX96 Bio-Rad Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad） 分别对tyrB、yddG和ihfB基因进行荧光定量PCR扩增，tyrB、yddG和ihfB基 因的扩增上下游引物碱基序列（TyrBa、TyrBb，YddGa、YddGb，ihfBa、ihfBb） 分别如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21以及SEQ  ID NO:22、SEQ ID NO:23所示，扩增条件如下：预变性95℃30s,然后95℃5s， 60℃35s循环40次，并采用梯度稀释法获得标准曲线，yddG：y=-3.286x+11.895 （E=101.5%R²=0.981）；tyrB:y=-3.334x+15.335（E=99.5%R²=0.988）；ihfB： y=-3.364+21.121（E=98.3.1%R²=0.988），采用2^-ΔΔC_T法（参考文献如下：Livak  K,Shmittgen TD(2001)Analysis of relative gene expression data using  real-time quantitative PCR and the2^-ΔΔC_T method.Methods25:402–408）计算tyrB 和yddG的表达水平，与E.coli W3110相比，E.coli W14菌株中tyrB和yddG 的表达水平在培养第11h分别提高至4.85和5.17，第15h分别提高至12.57和 5.97，证明E.coli W14菌株可同时过量表达tyrB和yddG。以上数据分析采用 CFX Manager 3.0（Bio-Rad）进行。

实施例5 yddG的过量表达对胞内和胞外L-苯丙氨酸浓度的影响

M9培养基中胞内胞外L-苯丙氨酸浓度测定方法：将E.coli W14和E.coli W3110（同实施例4，对照菌株）分别接种于LB培养基，于200rpm培养9h后， 升温至38℃继续培养2h，取出菌体用无菌生理盐水（0.9%NaCl）洗涤两次，再 用M9培养基（先配制5×M9盐溶液：Na₂PO₄·7H₂O 12.8g，KH₂PO₄ 3.0g，NaCl 0.5g，NH₄Cl 1.0g，灭菌，使用时取5×M9盐溶液200ml，加入已灭菌的1mol/L 的MgSO₄ 2ml，1mol/L的CaCl₂ 0.1ml，20%葡萄糖溶液20ml，用灭菌双蒸水 定容至1000ml）调整OD₆₀₀至6，于38℃培养，在1h、2h、3h和8h取样测定 胞内胞外L-苯丙氨酸浓度。胞内L-苯丙氨酸测定方法如下：取适量发酵液调整 OD₆₀₀至3（相当于菌体数量为1～2×10⁹CFU/ml），离心收集1mL菌体，水洗两 次，加入250μL 35%高氯酸于振荡器剧烈振荡5min，加入280μL 2.7mol/L Na₂CO₃中和，离心除去细胞碎片，用作液相分析，L-苯丙氨酸浓度测定方法同实施例1 （假设大肠杆菌细胞体积为1μm³）。实验结果参见表1和表2。

表1 M9培养基中胞外L-苯丙氨酸浓度变化

表2 M9培养基中胞内L-苯丙氨酸浓度变化

由表1和表2数据可知，在M9培养基中培养8h以后，E.coli W14胞内L- 苯丙氨酸浓度明显低于对照菌株，同时胞外L-苯丙氨酸浓度较对照菌株也有所 提高，证明yddG的过量表达增强了L-苯丙氨酸的胞外分泌。

实施例5 E.coli W14的15L发酵罐发酵培养

配制6L液体发酵培养基装于15L发酵罐中，121℃灭菌20min，调整初始 葡萄糖浓度为15g/L，加入浓氨水调整pH值至7.5，调整通气量为0.5vvm，发 酵罐温度为35℃，将LB培养基中培养12h的活化种子液接种入发酵罐中，培 养到OD₆₀₀为3时，调整发酵温度至42℃，开大通风量至0.8vvm，同时改变搅 拌转速控制溶氧量为10～35%，以2g/L/h的速率流加600g/L的葡萄糖溶液控制 葡萄糖浓度为1～4g/L，通过流加浓氨水控制pH值为6.5～7.5，共发酵48h。发 酵结束，测定发酵液中L-苯丙氨酸浓度为46g/L，乙酸浓度为2.4g/L，菌体干重 达到40g/L，测定方法同实施例2。

实施例6 E.coli W14的30L发酵罐发酵培养

配制20L液体发酵培养基装于30L发酵罐中，115℃灭菌30min，调整初 始葡萄糖浓度为3g/L，加入浓氨水调整pH值至6.5，调整通气量为0.8vvm，发 酵罐温度为42℃，将LB培养基中培养12h的活化种子液接种入到发酵罐中， 培养至OD₆₀₀为15时，调整发酵温度到38℃，开大通风量至1.0vvm，,同时改 变搅拌转速控制溶氧量为10～35%，以2g/L/h的速率流加600g/L的葡萄糖溶液 控制葡萄糖浓度在1～4g/L之间，通过流加浓氨水控制pH在6.5～7.5之间，共发 酵65h。发酵结束，测定发酵液中苯丙氨酸浓度为62g/L，乙酸为浓度2.7g/L， 菌体干重达到30g/L，测定方法同实施例2。

上所述的仅是本发明的优选实施方式，本发明不限于以上实施例。可以理 解，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的前提下直接导出或联想到 的其它改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围之内。