H3型组蛋白及其抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用

摘要

本发明涉及一种H3型组蛋白在烟草青枯病抗性检测中的应用。较佳地，所述H3型组蛋白作为烟草青枯病抗性蛋白标志物。较佳地，所述H3型组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明还涉及一种抗H3型组蛋白抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用。本发明的H3型组蛋白及其抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用可以简单、方便、快速、可靠、灵敏地检测烟草青枯病抗性，为筛选烟草青枯病抗性品种以及辅助传统的抗病杂交育种提供一条全新的途径，适于大规模推广应用。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术检测技术领域，特别涉及烟草青枯病抗性检测技术领域，具体是指一种H3型组蛋白及其抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用。

背景技术

烟草青枯病是热带、亚热带地区烟草的主要病害之一，目前在中国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、江西、广西东部、安徽南部、四川及贵州局部烟区为害严重，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。近几年来，该病的发病和为害范围有向北方烟区扩展的趋势，在山东、河南、陕西及辽宁等省都有发生，局部地区为害较重。目前该病造成的损失已居各类病害的第4位，因此，寻找有效的防治青枯病的方法和培育具有青枯病抗性的烟草品种是当前植物病理学和育种学研究的重要方向之一。

到目前为止，防治烟草青枯病最好的方法是利用抗病杂交品种。据统计至2011年底，在世界范围内种植的烟草品种已达2000份以上，其中主栽品种超过400份。所以，如何对这些烟草品种的青枯病抗病性进行合理的筛选并评价这些宝贵的种质资源、最后应用这些资源以培育出对青枯病高抗的烟草品种具有十分重要的意义。

因此，为筛选和培育的目的而进行研究和开发在烟草青枯病抗性品种中高表达的基因和/或蛋白质具有重要意义。本领域迫切需要新的在烟草青枯病抗性品种中高表达的基因和/或蛋白质。

蛋白质烟草H3型组蛋白（Histone H3）的NCBI登录号为gi|3273350|，Uniport登录号为A7VMF1。H3型组蛋白是组成真核细胞染色体核小体主要成分之一，一个核小体由两个H2A，两个H2B，两个H3，两个H4组成的八聚体和147bp缠绕在外面的DNA组成。研究表明，这些组成成分的核心部分状态大致是均一的，游离在外的N-端则可以受到各种各样的修饰，包括组蛋白末端的乙酰化，甲基化，磷酸化，泛素化等等。所以组蛋白的修饰与基因表达调控有关。

目前研究发现组蛋白是不可缺少的动态转录调控成分，会发生许多组蛋白翻译后的共价化学修饰，包括乙酞化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化及ADP-核糖基化等，这些修饰通常发生于组蛋白的氨基端尾部，它们通过改变组蛋白-DNA和组蛋白-组蛋白的相互作用而引起染色质的结构和功能变化，影响基因表达并且这种影响取决于氨基末端被修饰的位点。在四种核心的组蛋白中，H3似乎拥有较多的修饰位点，这些调控涉及到基因调控和染色质组装等过程。组蛋白H3系列蛋白已经被报导存在于很多植物中，然而它们的表达模式和在很多研究常用植物中的拷贝数现在还不是很清楚。

有文献报道，H3型组蛋白可能与水胁迫有关，水能够调节水稻H3，小麦H3与一个与盐胁迫相关的蛋白WAF1相互作用。水稻根部的RH13.2基因在盐胁迫下表达量增加。

到目前为止，还没有蛋白质烟草H3型组蛋白与烟草青枯病有关的报道。

发明内容

为了解决上述存在的问题，本发明的目的是提供一种H3型组蛋白及其抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用，该H3型组蛋白及其抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用可以简单、方便、快速、可靠、灵敏地检测烟草青枯病抗性，为筛选烟草青枯病抗性品种以及辅助传统的抗病杂交育种提供一条全新的途径，适于大规模推广应用。

为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种H3型组蛋白在烟草青枯病抗性检测中的应用。

较佳地，所述H3型组蛋白作为烟草青枯病抗性蛋白标志物。

较佳地，所述H3型组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的第二方面，提供了一种抗H3型组蛋白抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明可以通过H3型组蛋白在烟草青枯病抗性检测中的应用，从而可以简单、方便、快速、可靠、灵敏地检测烟草青枯病抗性，为筛选烟草青枯病抗性品种以及辅助传统的抗病杂交育种提供一条全新的途径，适于大规模推广应用。

2、本发明还可以通过抗H3型组蛋白抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用，从而可以简单、方便、快速、可靠、灵敏地检测烟草青枯病抗性，为筛选烟草青枯病抗性品种以及辅助传统的抗病杂交育种提供一条全新的途径，适于大规模推广应用。

附图说明

图1是H3型组蛋白的免疫印迹分析结果图。其中A为采用肌动蛋白Actin抗体对内源Actin进行免疫印迹的结果图，B为采用鼠源H3型组蛋白单克隆抗体对H3型组蛋白进行免疫印迹的结果图，1，2，3均为抗病品种DB101的蛋白质样品，4，5，6均为感病品种红花大金元的蛋白质样品。

具体实施方式

本发明的原理为：通过筛选在烟草青枯病抗性品种以及烟草青枯病感病品种中差异表达的蛋白质，申请人找到了一种在抗性品种和感病品种中存在差异表达的蛋白质（在抗性品种中上调表达），经质谱鉴定为H3型组蛋白。用同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags forrelative and absolute quantification，iTRAQ）蛋白质组学方法，使用稳定同位素标记不同抗性烟草品种叶片蛋白质酶解之后的肽段，通过鸟枪法（shotgun）技术，结果发现蛋白质H3型组蛋白在烟草青枯病抗性品种中上调表达。免疫印迹实验进一步证实蛋白质烟草H3型组蛋白的确在不同烟草青枯病抗性品种中存在差异表达。

基于蛋白质烟草H3型组蛋白与烟草青枯病抗性的这种相关性，本发明首先提供了蛋白质烟草H3型组蛋白在烟草青枯病抗性检测中的应用。如果蛋白质烟草H3型组蛋白在待检烟草品种中呈上调表达，则提示该待检烟草品种对青枯病具有较高的抗性。另外，本发明还提供了烟草H3型组蛋白的抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用。

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特列举以下具体实施例详细说明。然而，具体实施例仅仅是用于举例说明，而不是对本发明的限制。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1、烟草青枯病抗性品种DB101及感病品种红花大金元蛋白质样品的制备

本实施例中所使用的三氯乙酸（TCA）、丙酮、盐酸均购自国药公司；二硫苏糖醇（DTT）、十二烷基磺酸钠（SDS）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）均购自BioRad公司。SDT裂解液（4%SDS,1mM DTT,150mM Tris-HCl pH8.0）。

本实施例以TCA-丙酮以及SDT裂解的方法制备烟草叶片蛋白质样品。具体如下：

分别取青枯病抗性品种DB101和感病品种红花大金元各3株在相同的条件下进行培养，在出苗65天后取所有叶片，立即在清水中洗净，吸水纸吸干水分，然后用铝箔纸包裹，于-80℃冰箱备用。称取1.2g左右叶片，用液氮研磨成粉末并转入50ml离心管中，加入25ml TCA/丙酮（1：9），65mM DTT，-20℃沉淀1小时。离心10000rpm，45分钟，去除上清。沉淀加入25ml纯丙酮，-20℃沉淀1小时，离心10000rpm，45分钟，去除上清。沉淀加入25ml纯丙酮，-20℃沉淀1小时，离心10000rpm，45分钟，去除上清。空气干燥，粉末-80℃保存。取0.5g粉末于1.5mL离心管中，加入1mL SDT裂解液中，沸水浴5min，再进行超声处理（80w，超声10s，间歇15s，共10次）沸水浴5min，超声后样品再次进行沸水浴5min，最后进行离心，12000g，20℃离心1h，取上清。上清浓度测定采用BCA protein assay reagent（Beyotime碧云天）进行总蛋白定量，定量结果见表1。制备好的蛋白质样品进行分装，-80℃保存备用。取制备好的DB101和红花大金元共6个蛋白质样本各100μg充分混匀成并制作成内标（IN）；后续的实验中内标用IS表示，DB101样本用D表示，红花大金元样本用H表示。

表16例样本的蛋白质定量结果

样本D1D2D3H1H2H3浓度（μg/μL）7.237.486.847.067.517.42

实施例2、抗病品种DB101、感病品种红花大金元和内标IS蛋白质样品FASP（Filter aidedproteome preparation）酶解

本实施例中所使用尿素（urea）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、吲哚-3-乙酸（IAA）购自Bio-Rad公司；胰酶（Trypsin）购自Sigma公司。溶解溶液（Dissolution buffer）购自AB SCIEX公司。

将实施例1中的7个样本（1个IS、3个H和3个D）各取200μg并同时进行如下操作：首先加入200μLUAbuffer（8M Urea，150mM Tris-HCl pH8.0）混匀，转入30kDa超滤离心管，离心14000g15min。加入200μl UAbuffer离心14000g15min，弃滤液。加入100μL IAA（50mMIAA in UA），600rpm振荡1min，避光室温30min，离心14000g10min。加入100μl UA buffer，离心14000g10min重复2次。加入100μL Dissolution buffer，离心14000g10min重复2次。加入40μLTrypsin buffer（2μgTrypsin in40μLDissolution buffer），600rpm振荡1min，37℃16-18h。换新收集管，离心14000g10min，取滤液，OD280肽段定量，定量结果见表2。

表27例蛋白质样本的肽段OD280值

样本ISD1D2D3H1H2H3OD2802.832.912.782.742.843.012.91

实施例3、运用iTRAQ（isobaric tagsforrelative and absolute quantification）技术进行抗病烟草品种和感病烟草品种的差异表达蛋白的筛选

标记试剂盒iTRAQ Reagent-8plex Multiplex Kit购自AB SCIEX公司；离子交换色谱仪为AKTA Purifier100，购自GE Healthcare；色谱柱为Polysulfoethyl4.6x100mm column(5μ,)，购自PolyLCInc公司；脱盐柱使用C18Cartridge，购自Sigma；分析软件使用ProteomicsTools（Version:3.0.5）(http://www.proteomics.ac.cn/)。

按照ABI公司说明书取等量肽段（50μg）进行同位素标记，标记方案如表3。

表3iTRAQ实验同位素标记方案

样本ISD1H1D2H2D3H3同位素113114115116117118119

取所有标记后样本进行合并，合并样本进行离子交换色谱柱（SCX）分级，收集穿流及洗脱fraction约30份，根据SCX色谱图合并成10份，冻干后C18Cartridge（Sigma）脱盐。样品采用纳升流速HPLC液相系统EasynLC进行分离，上样量为5μL。缓冲液：A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%）。色谱柱以95%的A液平衡。样品由自动进样器上样到上样柱Thermo scientific EASY column(2cm×100μm5μm-C18)，再经分析柱Thermo scientific EASY column(75μm×100mm3μm-C18)分离，流速为400nl/min。相关液相梯度如下：0分钟-100分钟，B液线性梯度从0%到35%；100分钟-108分钟，B液线性梯度从35%到100%；108分钟-120分钟，B液维持在100%。样品经毛细管高效液相色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。分析时长：120min，检测方式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：70,000at m/z200，AGC target：3E6，一级MaximumIT：20ms，Number of scan ranges：1，Dynamic exclusion：40.0s。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描（full scan）后采集10个碎片图谱（MS2scan），MS2Activation，Type:HCD，Isolation window：2m/z，二级质谱分辨率：17,500at m/z200，Microscans：1，二级Maximum IT：60ms，Normalized collision energy：27eV，Underfill ratio：0.1%。

数据处理使用的数据库为Uniprot烟草数据库，下载日期2012年5月13日，蛋白质序列为5219条。数据库文件经软件处理添加反相数据库（reverse database）形成Uniprot_Nicotiana_20120513_REVERSED.fasta，然后用于查库及FDR分析。搜库软件为Mascot（version2.2），结果过滤参数为：Protein FDR≤0.01；Peptide FDR≤0.01。搜库结果的定量分析如下：抽提肽段报告离子峰强度值信息，并以各标签通度值的中位数对信号强度进行归一化处理。肽段定量结果为参考样品所在标签的信号强度值与其他标签的信号强度值的比值。蛋白质定量结果为鉴定肽段定量结果的中位数。最终定量结果再以各标签比值中位数进行归一化处理，以消除实验中人为因素引入的上样量误差。

应用SDT样本裂解方法，FASP酶解技术、iTRAQ标记技术、质谱技术，本实施例共鉴别出了613个蛋白质，差异表达蛋白质有195个，在抗病品种DB101中高表达的为90种蛋白质，在感病品种红花大金元中高表达的为105种蛋白质。

在差异表达蛋白质列表中，我们发现编号为334的蛋白质在抗病烟草DB101中表达明显上调，较感病品种红花大金元上调5倍，学生T检验P值为3.27E-05，达到极显著水平。

随后经过LC-MS/MS质谱鉴定和数据库搜索得3个非重复肽段（共鉴定到8个肽段）与蛋白质H3型组蛋白相符并满足打分条件（False Discovery Rate≤0.01、maxium peptide fdr≤0.01、Score≥20），氨基酸覆盖率为16.91%，具体结果详见以下表4。H3型组蛋白序列见SEQ IDNO：1。：

表4H3型组蛋白质谱鉴定结果

肽段序列质量数(MH+)电荷数得分K.STELLIR.K1135.69877221.96K.STELLIR.K1135.69877330.48R.EIAQDFK.T1458.84122225.01R.EIAQDFK.T1458.84122322.77R.FRPGTVALR.E1320.80533324.38R.FRPGTVALR.E1320.80533421.71R.FRPGTVALR.E1320.80533320.52K.STELLIR.K1135.69877221.96

实施例4、蛋白质H3型组蛋白的免疫印迹验证

为确认蛋白质H3型组蛋白的差异表达，我们选用了实施例1中6例样本（3株抗病品种DB101以及3株感病品种红花大金元）的蛋白质裂解液样品，用购买的抗蛋白质H3型组蛋白抗体进行免疫印迹分析，具体过程简述如下：每个样品取20μg蛋白质样品用12.5%SDS-PAGE分离，转移至PVDF膜（购自Amersham Biosciences公司）上，一抗使用鼠源蛋白质H3型组蛋白单克隆抗体（购自Abmart,Inc,1:2000），4℃孵育过夜，用TBST（每升含Tris2.42g,氯化钠8g,Tween20ml,用HCl调节pH到7.6）洗涤三次，每次5分钟，二抗为抗鼠抗体（购自Santa Cruz公司，1:10000），室温孵育1小时，再用TBST洗涤三次，每次10分钟，最后用ECL plus试剂（Amersham Biosciences）反应5分钟后，用Typhoon FLA9000（GE Healthcare）荧光扫描仪进行扫描，检测结果如图1所示。本实施例中同时选用肌动蛋白Actin抗体做为内参进行对照试验，Actin抗体购自Abmart,Inc,1:20000进行使用，其他步骤与上述过程一致。

图1的免疫印迹结果显示，6个样品中肌动蛋白Actin灰度值基本保持一致，使用ImageQuant TL2.0软件（GE Healthcare）对6例样本中蛋白质H3型组蛋白的杂交条带进行光密度分析，分析结果见表5。分别取3株抗病品种DB101光密度值的均值与感病品种红大光密度值均值比较，发现光密度值在抗病品种中上调表达3.12倍，学生T检验P值为0.046，达到显著水平。从以上结果可得出蛋白质H3型组蛋白在烟草青枯病抗性品种中存在高表达。

表56例样本免疫印迹验证结果

样本DB101DB101DB101红大红大红大光密度值5.53E+063.16E+062.76E+061.60E+061.54E+065.58E+05

综上所述，蛋白质H3型组蛋白在青枯病不同抗性烟草品种中存在差异表达，显然与青枯病抗性有着密切的相关性，因此其表达量可以作为一个指标用于烟草对青枯病抗性的检测。相应的，特异性抗蛋白质H3型组蛋白的抗体，由于其能够用于检测蛋白质H3型组蛋白的表达量，因而可以用于检测烟草对青枯病抗性能力的强弱，这对于利用传统杂交育种手段进行筛选抗并烟草品种的技术人员来说是显而易见的。

虽然有关蛋白质H3型组蛋白的生物学功能及其相应的抗病机制还有待进一步研究，但是将其作为检测不同烟草品种对青枯病抗性的标记物却是肯定的。

综上，本发明的H3型组蛋白及其抗体在烟草青枯病抗性检测中的应用可以简单、方便、快速、可靠、灵敏地检测烟草青枯病抗性，为筛选烟草青枯病抗性品种以及辅助传统的抗病杂交育种提供一条全新的途径，适于大规模推广应用。

在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。