不同基因型戊型肝炎病毒重组蛋白用于抗体检测的价值及应用

摘要

戊型肝炎(Hepatitis E, HE)是一种经粪口途径传播的急性传染病，在世界各地发展中国家广泛流 行，在发达国家也有散发，严重危害着人类健康。HE病死率约为0.4％，远较其他各型肝炎高，特 别是在孕妇中HE的死亡率可高达20％。戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus，HEV)是HE的病原体，其 基因组为单股正链RNA，含三个开放读码框(Open Reading Frame，ORF)。根据全基因序列分析，HEV 在全世界主要有4个基因型：以缅甸株为代表的第Ⅰ基因型、以墨西哥株为代表的第Ⅱ基因型、以 美国株为代表的第Ⅲ基因型和以中国株为代表的第Ⅳ基因型，其中第Ⅰ基因型至少包括3个亚型， 分别以缅甸株(Ia)、巴基斯坦株(Ib)和摩洛哥株(Ic)为代表。现已发现猪、啮齿类动物、牛、鸡、 羊等也可以感染HEV，它们在HE传播中可能起了重要作用，使该病成为一种人畜共患疾病。 目前HE的诊断主要依靠免疫诊断。由于抗原抗体反应的特异性，一个好的抗体检测试剂的关 键取决于抗原的选择。目前国内外市售的抗-HEV抗体ELISA试剂盒是用HEV基因Ⅰ型或/和基因 Ⅱ型的抗原制备的，对某些感染基因Ⅲ和Ⅳ型HEV的HE患者常有漏诊。有学者研究发现，基因 工程表达的ORF2全长蛋白其C端的抗原表位由于肽链的折叠而被遮盖，切去N端部分肽链的ORF2 蛋白抗原性反而更好。Meng等在研究HEV中和抗原表位定位的过程中发现全长ORF2蛋白诱导中 和抗体的能力比C端ORF2蛋白片段弱。我们最近用基因工程重组技术表达和纯化了不同基因型和 亚型C端ORF2蛋白片段(重组蛋白p166)，并通过制备单克隆抗体对这些p166蛋白进行抗原表 位分析，发现不同基因型和亚型来源的重组蛋白p166存在着基因型共同的抗原表位、Ⅰ和Ⅱ基因型 共同的抗原表位、Ⅲ和Ⅳ基因型共同的抗原表位以及基因型特异性的抗原表位。因此，不同基因 型和亚型的HEV重组蛋白p166在HEV抗体检测中的敏感性是否存在差异，何种p166是用于HEV 抗体检测的最佳抗原等问题值得深入探讨。 我国是HEV的高发区，1986-1988年我国新疆地区曾发生过HE大流行，十几万人受感染，死 亡700余人，是迄今为止世界上最大、最严重的一次HE流行。了解我国HEV感染特征对研制和使 用HEV疫苗从而达到预防和控制HEV感染十分重要和迫切。刘崇柏等曾于1992年对我国13个省、 市、自治区进行过人群HEV流行率的研究，但由于当时采用的Genelabs ELA诊断试剂现已被证实 存在较大缺陷，存在一定程度的漏检和误诊，所以结果的准确性受到影响，因此有必要采用新一代 的HEV抗体检测试剂重新开展全国性的调查。 本研究对7种不同基因型和亚型HEV(包括人和猪)重组抗原用于抗体检测的价值作深入的探 讨，拟建立一种新的可靠的HEV抗体检测方法，对我国正常人群再次进行一次大规模的HEV血清 流行病学调查，从而更好更准确地了解我国HEV人群流行病学特征和流行趋势，为HEV疫苗的研 制和应用提供科学依据。本研究分为三部分： 一、不同基因型戊型肝炎病毒p166抗原用于抗体检测的价值 用7种等浓度的不同基因型和亚型HEV p166重组蛋白，包括：p166Bur(缅甸株)、p166Pak (巴基斯坦株)、p166Mor(摩洛哥株)、p166Mex(墨西哥株)、p166Us(美国株)、p166Nzs(新 西兰猪株，基因型Ⅲ型)、和p166Chn(中国株)以及这7种蛋白的混合物p166Mix作为包被抗原， 对血清标本进行酶联免疫吸附试验(ELISA)测定。用HEV多基因型通用性引物进行逆转录-巢式聚 合酶链式反应(RT-nPCR)扩增标本中的HEV RNA，并测序、分型。结果8种不同p166抗原对30 份正常献血者血清无抗原性，对182份来自世界不同国家和地区的已知HEV抗体阳性血清和7份 HEV实验感染动物血清标本均呈阳性反应，血清抗体滴度的高低与所用抗原的基因型有明显关系。 RT-nPCR检测的50份中国血清标本中，19份阳性，基因分型均为Ⅳ型，这19份血清经过ELISA 检测，有16份标本的ELISA滴度相差4倍以上，均以p166Chn终点滴度为最高，其次为p166Mix。 以猪HEV新西兰株和人HEV美国株重组蛋白检测血清标本，两者结果无显著差异，说明用新西兰 猪株的重组抗原不仅可以检测动物的HEV IgG抗体，也可用于检测人抗体。以上结果表明不同基因 型和亚型的HEV重组蛋白p166在HEV抗体检测中的敏感性高低不同，不同基因型和亚型p166的 混合抗原是HEV抗体检测的最佳抗原。 二、抗-HEV IgG抗体间接法ELISA的建立及评价 我们在分析了HEV不同基因型和亚型p166重组蛋白抗原性差别的基础上，用p166Mix抗原建 立了间接法ELISA检测抗-HEV IgG抗体并进行了相关试验，确定最佳包被稀释度和酶标抗原稀释 度，选择合适的包被液、酶标微孔板、标本稀释液、酶标抗体稀释液、标本稀释度，对其敏感性、 特异性、稳定性和重复性进行评价。结果用本方法检测中国HE病人和世界上其他七个不同国家的 血清标本发现，阳性符合率为100％；对210份国内外献血者血清标本检测结果均为阴性，与CDC 检测结果完全一致；本方法在4℃可以稳定保存6个月以上，重复性好，稳定性高。表明建立的抗 -HEV IgG抗体间接法ELISA检测试剂具有敏感性高、特异性强、适用面广等特点。 三、全国范围大规模人群戊型肝炎病毒感染的调查 收集13021份来自江苏、安徽、河北、河南、湖南、吉林、陕西、山西、北京、重庆等10个不 同省、市的血清标本，以建立的间接法ELISA检测所采集血清的抗-HEV IgG抗体。对检测结果进 行统计学处理。结果发现我国目前的HEV感染率是18.20％；总体男女性别感染率分别为18.45％和 17.89％，两者之间没有统计学差异，与1992年调查结果一致；总体HEV感染率31-50岁年龄段递 增趋势不明显，而0-30岁间和41-60岁间感染率随年龄增长而明显升高；各省、市间感染率不同， 山西省HEV感染率最低，为5.74％，陕西省最高，为27.24％，其次为重庆市，HEV感染率为25.47％， 而江苏省扬州市是本次调查中HEV感染率最高的地区，达33.13％；江苏省和湖南省的HEV感染率 较1992年明显提高，而吉林省、河北省和北京市的HEV感染率则较1992年明显下降；长江以南的 地区居民HEV感染率为20.95％，较长江以北地区感染率(15.50％)要高1.35倍，与1992年调查结果 恰好相反，其中31-40岁年龄组差别更为明显，长江以南地区比长江以北地区要高1.75倍。 综上所述，我们认为单个不同基因型和亚型的HEV重组蛋白p166对HEV抗体检测均有一定价 值，猪HEV重组蛋白也可用于人HEV抗体的检测，但不同基因型和亚型p166的混合抗原是HEV 抗体检测的最佳抗原。对以混合抗原p166Mix制备的HE免疫诊断试剂进行多种评价后，发现其具 有敏感性高、特异性强、适用面广等特点，不仅可以用于中国各地，也可以用于世界各国。对全国 不同省、市的血清标本进行检测，发现目前我国存在人群HEV感染，性别感染没有明显差异。HEV 感染具有一定的地域分布差异，不同省、市间HEV感染率存在差别，长江以南地区明显高于长江以 北地区。HEV感染率有随年龄升高而缓慢上升的趋势。

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前言

第一章 不同基因型戊型肝炎病毒p166抗原用于抗体检测的价值

第二章 抗-HEV IgG抗体间接法ELISA的建立及评价

第三章 全国范围大规模人群戊型肝炎病毒感染的调查

结论

参考文献

作者简介

戊型肝炎病毒分子生物学及其检测方法研究进展

致谢