一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒。本发明的试剂盒在两管PCR体系中即可完成16个位点16种突变的检测，PCR扩增结束经一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道样本基因型，整个操作在2～3小时即可完成，操作步骤少，耗时短，通量高，且检测位点多，突变覆盖率高；此外本发明的试剂盒采用均相检测、闭管操作，减少了PCR产物污染的可能性，且检测特异性高，结果容易判读。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种应用荧光PCR熔解曲线分析检 测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变的试剂盒。

背景技术

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症(G6PD deficiency)是最常见的人类酶缺陷病 之一，其病因是G6PD基因突变导致葡萄糖-6-磷酸脱氢酶合成减少。然而， 绝大部分患者的生活质量并没有因此降低，这主要是由于在我国出现的绝大 部分G6PD缺乏症患者只有在诱因的存在下才会出现相应的临床症状，因此， 完全可以通过预先防范和及时接受正确的治疗而有效的避免上述情况的发 生。所以在我国G6PD缺乏症的高发区进行全民筛查是十分必要的。

目前G6PD缺乏症的临床诊断方法包括生化检测方法和分子生物学检测 方法，其中生化筛查是传统诊断方法，通过直接或者间接地测定G6PD的酶 活性来筛查G6PD缺乏症的携带者和患者。主要包括进行定性检测的高铁血 红蛋白还原试验、荧光斑点试验、硝基四氮唑蓝（NBT）纸片法和进行定量 检测的NBT定量法、NADPH定量比值法等。分子生物学方法是基于DNA 的分析进行G6PD基因突变的检测，如反向点杂交（RDB）、PE/DHPLC、 AS-PCR、PCR-SSCP、基因芯片等。生产厂家主要有杭州纽罗西敏生物科技 有限公司和Solgent有限公司等。国内临床常用的方法为检测酶活性的生化 检测法和反向点杂交法。

生化检测方法虽然检测成本低、检测时间短，但其存在以下缺点：（1） 对女性杂合子的检出率低，仅为20~45%左右；（2）结果易受实验条件，操 作人员等因素影响。

现有的分子检测方法虽然能较好地解决G6PD缺乏症女性杂合子检测的 问题，但是不同的方法有着自身的局限性。反向点杂交法是一种异相的突变 检测方法，需要对PCR产物进行后续处理，操作步骤较多，容易引起污染， 并且结果判读易受主观因素影响。PE/DHPLC对仪器要求设备高，应用性不 强。AS-PCR检测的通量十分有限，而且需要PCR后处理，容易出现污染造 成假阳性结果的发生。PCR-SSCP对实验条件要求严格，只能检测突变是否 存在，对于突变的具体位置和类型还需要进一步的测序。此外，由于某些点 突变类型对单链DNA的空间构象改变小，容易漏检。基因芯片技术不但成 本高、操作复杂而且结果存在不同程度的假阳性。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种应用荧光PCR熔解曲线 分析检测葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变的试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变荧光PCR熔解曲线检测试剂盒，该 试剂盒包括：

特异扩增五种突变位点c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、c.1387C>T 和c.1388G>A所在序列的上游引物F1和下游引物R1，其中，F1的碱基序列 如SEQ ID NO：1所示，R1的碱基序列如SEQ ID NO：2所示；

特异扩增三种突变位点c.871G>A、c.1004C>A和c.1024C>T所在序列的 上游引物F2和下游引物R2，其中，F2的碱基序列如SEQ ID NO：3所示， R2的碱基序列如SEQ ID NO：4所示；

特异扩增突变位点c.95A>G所在序列的上游引物F3和下游引物R3其 中，F3的碱基序列如SEQ ID NO：5所示，R3的碱基序列如SEQ ID NO：6 所示；

特异扩增两种突变位点c.383T>C和c.392G>T所在序列的上游引物F4 和下游引物R4，其中，F4的碱基序列如SEQ ID NO：7所示，R4的碱基序 列如SEQ ID NO：8所示；

特异扩增五种突变位点c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T和 c.592C>T所在序列的上游引物F5和下游引物R5，其中，F5的碱基序列如 SEQ ID NO：9所示，R5的碱基序列如SEQ ID NO：10所示；

以及用于检测上述十六种突变位点的荧光探针。

在本发明的一个优选实施方案中，所述荧光探针包括：

用于检测突变位点c.1360C>T的荧光探针P1，其碱基序列如SEQ ID NO： 11所示；

用于检测突变位点c.871G>A的荧光探针P2，其碱基序列如SEQ ID NO： 12所示；

用于检测突变位点c.1004C>A和c.1024C>T的荧光探针P3，其碱基序列 如SEQ ID NO：13所示；

用于检测突变位点c.1376G>T、c.1388G>A、c.1381G>A和c.1387C>A 的荧光探针P4，其碱基序列如SEQ ID NO：14所示；

用于检测突变位点c.95A>G的荧光探针P5，其碱基序列如SEQ ID NO： 15所示；

用于检测突变位点c.383T>C和c.392G>T的荧光探针P6，其碱基序列如 SEQ ID NO：16所示；

用于检测突变位点c.487G>A和c.493A>G的荧光探针P7，其碱基序列 如SEQ ID NO：17所示；

用于检测突变位点c.517T>C和c.519C>T的荧光探针P8，其碱基序列如 SEQ ID NO：18所示；

用于检测突变位点c.592C>T的荧光探针P9，其碱基序列如SEQ ID NO： 19所示。

在本发明的一个优选实施方案中，所述荧光探针5’端的荧光基团包括 ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL Fluor Gold540、JOE、HEX、CAL Flour Orange560、TAMRA、Cal Fluor Red590、ROX、CAL Fluor Red610、TEXAS RED、CAL Flour Red635、Quasar670、CY3、CY5、CY5.5或Quasar705， 所述荧光探针3’端的淬灭基团包括DABCYL、BHQ、ECLIPSE或TAMRA。

在本发明的一个优选实施方案中，该试剂盒包括检测体系A和检测体系 B，

所述检测体系A包括：1×PCR buffer、1U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP、2.5mM MgCl₂、上游引物F1、F2各1pmol、下游引物R1、R2各5pmol 及荧光探针P1、P2、P3、P4各5pmol；

所述检测体系B包括1×PCR buffer、1U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP、 2.5mM MgCl₂、上游引物F3、F4、F5各1pmol、下游引物R3、R4、R5各5 pmol及荧光探针P5、P6、P7、P8、P9各5pmol；

上述1×PCR buffer中包括：Tris-HCl pH8.510mM、KCl50mM和50% （v/v）甘油。

在本发明的一个优选实施方案中，所述检测体系A和检测体系B的荧光 PCR熔解曲线检测程序如下：

（1）50℃2min，95℃10min

（2）95℃15s→65℃~56℃15s→76℃20s，10个循环，其中65℃~56℃15s 每个循环下降1℃；

（3）95℃15s→55℃15s→76℃20s，50个循环，在55℃退火阶段采集 荧光信号；

（4）95℃1min→35℃3min→40℃~85℃，其中40℃~85℃以0.4℃/5s 的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集荧光信号。

本发明的有益效果是：

1、简便快速、耗时短：本发明在两管PCR体系中即可完成16个位点 16种突变的检测，PCR扩增结束经一次荧光PCR熔解曲线分析就可知道样 本基因型，整个操作在2～3小时即可完成，操作步骤少、耗时短；

2、均相检测、闭管操作：本发明为均相检测体系，PCR及熔解曲线分 析都在同一封闭的反应管中完成，无需PCR后处理，减少了PCR产物污染 的可能性；

3、检测位点多、突变覆盖率高：本发明可同时检测G6PD基因16个位 点的16种突变，检测位点多，对中国人群的突变覆盖率高；

4、检测通量高：本发明基于荧光PCR熔解曲线分析技术，PCR之后只 需运行一个简单的熔解曲线分析步骤（在荧光PCR仪上40min以内完成）即 可完成，而PCR可以在普通仪器上运行，一台荧光PCR仪可配合多台普通 PCR仪完成熔解曲线分析，故可以大大提高检测通量，提高荧光PCR仪的 利用率；

5、检测特异性高、结果容易判读：本发明是通过熔解峰的熔点来判定突 变与否，结果易于判读，且不易出错，故检测特异性高。

附图说明

图1为实施例2中本发明的试剂盒的检测体系A的FAM荧光通道的检 测结果图；

图2为实施例2中本发明的试剂盒的检测体系A的HEX荧光通道的检 测结果图；

图3为实施例2中本发明的试剂盒的检测体系A的ROX荧光通道的检 测结果图；

图4为实施例2中本发明的试剂盒的检测体系A的Cy5荧光通道的检测 结果图；

图5为实施例2中本发明的试剂盒的检测体系B的FAM荧光通道的检 测结果图；

图6为实施例2中本发明的试剂盒的检测体系B的HEX荧光通道的检 测结果图；

图7为实施例2中本发明的试剂盒的检测体系B的ROX荧光通道的检 测结果图；

图8为实施例2中本发明的试剂盒的检测体系B的Cy5荧光通道的检测 结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式将结合附图，对本发明的技术方案进行进一步的 说明和描述。

实施例1

本试剂盒中的引物和探针根据Genebank中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因 序列及其突变位点设计，具体如下：

F1：5’-GGCATGTTCTTCAACC-3’（SEQ ID NO：1），

R1：5’-GCCCTCATACTGGAAA-3’（SEQ ID NO：2），

F1/R1特异扩增五种突变位点c.1360C>T、c.1376G>T、c.1381G>A、 c.1387C>T和c.1388G>A所在序列；

F2：5’-AGAAGTCACCACCTCT-3’（SEQ ID NO：3），

R2：5’-GGCCACATCATGGAAC-3’（SEQ ID NO：4），

F2/R2特异扩增三种突变位点c.871G>A、c.1004C>A和c.1024C>T所在 序列；

F3：5’-TTTACTCGGTTGTCCAGAA-3’（SEQ ID NO：5），

R3：5’-GGCGACCAGAGCAAA-3’（SEQ ID NO：6），

F3/R3特异扩增突变位点c.95A>G所在序列；

F4：5’-TGCTCTCGTACTTCCTT-3’（SEQ ID NO：7），

R4：5’-TTGAAAATGAGAAGAGGACC-3’（SEQ ID NO：8），

F4/R4特异扩增两种突变位点c.383T>C和c.392G>T所在序列;

F5：5’-GAGGAAGCCATGGCTT-3’（SEQ ID NO：9），

R5：5’-AAACCGTGGGGTGCTT-3’（SEQ ID NO：10），

特异扩增五种突变位点c.487G>A、c.493A>G、c.517T>C、c.519C>T 和c.592C>T所在序列；

P1：5’-FAM-GGCCAGATGCACTTCGTGCGTGGCC-BHQ1-3’（SEQ ID NO：11），用于检测突变位点c.1360C>T；

P2：5’-HEX-AGCCGGTGTTGAAATGCATCTCAGAGGGCT-BHQ1-3’ （SEQ ID NO：12），用于检测突变位点c.871G>A；

P3：5’-ROX-GGCCACTTTTGCAGCCGTCGTCTGTGGCC-BHQ2-3’ （SEQ ID NO：13），用于检测突变位点c.1004C>A和c.1024C>T；

P4：5’-CY5-GGACCTCCTTGAGGCCTGGCGTGGTCC-BHQ2-3’（SEQ ID NO：14），用于检测突变位点c.1376G>T、c.1388G>A、c.1381G>A和 c.1387C>A；

P5：5’-FAM-GCGGCATATTCATCATCATGGGTGCCGC-BHQ1-3’（SEQ ID NO：15），用于检测突变位点c.95A>G；

P6：5’-FAM-GGCTCCACCTGGGGTCACAGGCGGAGCC-BHQ1-3’（SEQ ID NO：16），用于检测突变位点c.383T>C和c.392G>T；

P7：

5’-HEX-GCGCCAAGCTGGAACCGCATCATCGTGGAGAATGGCGC-BHQ1- 3’（SEQ ID NO：17），用于检测突变位点c.487G>A和c.493A>G；

P8：5’-ROX-GGGTTCGGGAGGGACCTGCAGAGCTAACCC-BHQ2-3’ （SEQ ID NO：18），用于检测突变位点c.517T>C和c.519C>T；

P9：5’-CY5-GGCCACGCATCGACCACTACCTGGGTGGCC-BHQ2-3’ （SEQ ID NO：19），用于检测突变位点c.592C>T。

本试剂盒中的检测体系包括检测体系A和检测体系B，

所述检测体系A包括：1×PCR buffer、1U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP、 2.5mM MgCl₂、上游引物F1、F2各1pmol、下游引物R1、R2各5pmol及 荧光探针P1、P2、P3、P4各5pmol；

所述检测体系B包括1×PCR buffer、1U Taq DNA聚合酶、200μM dNTP、 2.5mM MgCl₂、上游引物F3、F4、F5各1pmol、下游引物R3、R4、R5各5 pmol及荧光探针P5、P6、P7、P8、P9各5pmol；

上述1×PCR buffer中包括：Tris-HCl pH8.510mM、KCl50mM和50% （v/v）甘油。

上述检测体系A和检测体系B的荧光PCR熔解曲线检测程序如下：

（1）50℃2min，95℃10min

（2）95℃15s→65℃~56℃15s→76℃20s，10个循环，其中65℃~56℃15s 每个循环下降1℃；

（3）95℃15s→55℃15s→76℃20s，50个循环，在55℃退火阶段采集 FAM、HEX、ROX和CY5荧光信号；

（4）95℃1min→35℃3min→40℃~85℃，其中40℃~85℃以0.4℃/5s 的升温速率进行熔解曲线分析，且在此阶段采集FAM、HEX、ROX和CY5 荧光信号。

实施例2

应用实施例1的试剂盒进行检测分析，操作过程所使用的仪器为Bio-Rad CFX96实时荧光PCR仪：

（1）用实施例1的试剂盒中的5对引物分别扩增葡萄糖-6-磷酸脱氢酶 的16个突变位点，以此获得16个突变序列，将所得16个突变序列的PCR 产物分别插入pMD18-T质粒载体中，以此获得16个突变阳性标准品；

（2）将步骤（1）中获得的16个突变阳性标准品、葡萄糖-6-磷酸脱氢 酶野生型（Wt）序列和阴性对照（NTC）分别加入到实施例1的试剂盒的检 测体系中，并按实施例1的试剂盒的荧光PCR熔解曲线检测程序进行检测， 每个样本的检测体系A和检测体系B的模板加入量均为5微升，每微升3×10³拷贝；阴性对照为10mM Tris-EDTA缓冲液，pH8.0，加入量为5微升。

（3）结果判读：步骤（2）中每种萄糖-6-磷酸脱氢酶基因型的样品在不 同的荧光检测通道都有其特征Tm值（阴性对照中无熔解曲线检测信号），计 算野生型对照在各个通道的Tm值与16个突变阳性标准品在各个通道的Tm 值的差异，即ΔTm值，将所得ΔTm值与荧光探针和检测通道的关系归纳如 下表：

如图1至图8所示，本发明的试剂盒对上述16种萄糖-6-磷酸脱氢酶突 变类型都可检测出特异的熔解曲线检测信号，而且各个基因型间不存在交叉 检出的现象，因此在检测实际样品时可对照上表中的ΔTm值判读待测样品 的基因型。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施 的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍 属本发明涵盖的范围内。