稻谷内源性酶激活法生产高GABA功能食品材料的方法

摘要

本发明公开了一种稻谷内源性酶激活法生产高GABA功能食品材料的方法，在明确稻米内源性谷氨酸脱羧酶特性和活性调节机制的基础上，采用谷氨酸脱羧酶激活技术，生产高GABA含量的稻米健康食品；以富含GABA的发芽糙米为原料，采用钝化分解GABA的转氨酶预处理，生产留胚GABA精白米；采用含有谷氨酸脱羧酶激活剂和特殊缓冲体系的天然培养液进行发芽；以米糠、米胚芽作为GAD源，将其固定化后生产富集GABA的食品配料，并将其应用到GABA营养配合米粉生产中。本发明方法简便，可以加速开发富含GABA功能因子的食品材料，可作为或者用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。

说明书

技术领域

本发明涉及食品领域，特别是涉及利用稻谷内源性酶激活法生产高GABA功能食品材料的方法，改善食物产品结构和营养结构。

背景技术

作为一种具有多种生理功能的生物活性因子，GABA在美国、日本等国家已广泛用于营养补充剂和功能食品中，1996年，富含GABA的米胚芽制品在日本实现了商业化。日本科学家利用米胚芽等原料开发制造的富含GABA的功能食品配料，将其应用于饮料、果酱、糕点、饼干、调味料等制品中。现有报道显示，应用生物技术制造的高浓度GABA饮料以及利用乳酸菌等制作的富含GABA的食品配料，均可直接作为或者用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。上世纪九十年代中期，日本ORYZA油化学公司开发出一种名为GABARICEGERM的保健食品添加剂，其后不久，日本食品科学技术学会报道了该产品在改善失眠、抑郁和更年期综合症等方面的显著效果，证实了GABA的多种生理作用，并指出富含GABA的食品是一种功能性食品。2007年日本可口可乐公司推出了面向大众的、具有放松和抗紧张效果的GABA功能性饮料“AQUARIUS SHARP CHARGE”，GABA产品市场得到了进一步的扩展，而我国在这方面的研究尚处于起步阶段，亟待发展和提高。

利用高产GABA品种的发芽糙米内源酶转化提高发芽糙米中GABA的含量，对功能型稻米品种选育，稻米深加工及发芽糙米食品的研究开发具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种易操作，效果好的稻谷内源性酶激活法生产高GABA功能食品材料的方法。

本发明的技术解决方案是：

一种稻谷内源性酶激活法生产高GABA功能食品材料的方法，其特征是：

（1）在明确稻米内源性谷氨酸脱羧酶特性和活性调节机制的基础上，采用谷氨酸脱羧酶激活技术，生产高GABA含量的稻米健康食品；

（2）以富含GABA的发芽糙米为原料，采用钝化分解GABA的转氨酶预处理，生产留胚GABA精白米；

（3）采用含有谷氨酸脱羧酶激活剂和特殊缓冲体系的天然培养液进行发芽； 

（4）以米糠、米胚芽作为GAD源，将其固定化后生产富集GABA的食品配料，并将其应用到GABA营养配合米粉生产中。

一种稻谷内源性谷氨酸脱羧酶的制备方法，其特征是：包括下列步骤：

（1）γ-氨基丁酸的制备：称取糙米置于盘中，先用自来水冲洗一遍，洗去表面的杂质和灰尘，再加入4倍体积的水浸泡，将浸泡后的糙米均匀地摊于盘中，加入水，盖上湿润的纱布，发芽；然后称取发芽糙米，加入水磨成浆状，制成糙米浆；取一定量的糙米浆，在其中加入底物L-谷氨酸、辅酶PLP及激活剂CaCl₂ ，在PBS缓冲液中转化生成GABA；

（2）谷氨酸脱羧酶提取：称取发芽糙米，加入由磷酸缓冲液、维生素B₆、 EDTA、β-巯基乙醇及NaCL组成的提取缓冲液研磨匀浆，静置提取后离心，上清液即为谷氨酸脱羧酶提取液；

（3）谷氨酸脱羧酶分离纯化：谷氨酸脱羧酶提取液中加入(NH₄)₂SO₄至 30%饱和度，静置，冷冻离心去除部分杂蛋白；上清液加入(NH₄)₂SO₄至 50%饱和度，静置，冷冻离心弃去上清液，收集沉淀，沉淀溶于标准缓冲液；在标准缓冲液中透析至无 NH₄⁺，得到 GAD 粗酶液，冷冻干燥保存；采用 DEAE-Sephrose FF 阴离子交换柱对米胚 GAD 进行分离，控制米胚 GAD 的等电点在 4.5~4.7，分离采用磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱；再取经上述处理得到的米胚 GAD上Superdex 200 凝胶柱，用磷酸钾缓冲液反复洗脱，即得分离纯化后的谷氨酸脱羧酶。

所述的稻谷内源性谷氨酸脱羧酶的制备方法，包括下列步骤：

(1)γ-氨基丁酸制备：称取200g的糙米置于盘中，先用自来水冲洗一遍，洗去表面的杂质和灰尘，再加入4倍体积的水于40℃下浸泡12h；将浸泡后的糙米均匀地摊于铺有四层纱布的盘中，加入水,盖上湿润的纱布，置于35℃下发芽72h，得发芽糙米；称取50g发芽糙米，加入200mL水用高速组织捣碎机磨成浆状，得糙米浆；取一定量的糙米浆，在其中加入9.5mmol/L底物谷氨酸钠、辅酶PLP、 0.2mmol/L激活剂CaCl₂ ，在pH为6.5的PBS缓冲液中转化生成GABA，控制转化温度为40.0℃；

（2）谷氨酸脱羧酶提取：称取100g的发芽糙米，加入50mmol/L pH5.7磷酸缓冲液，0.5mmol/L维生素B₆，2mmol/L EDTA，0.2%的β-巯基乙醇，0.15mol/L NaCL的提取缓冲液研磨匀浆，定容至1000mL，静置提取2h后离心10min，上清液即为GAD 提取液；

（3）谷氨酸脱羧酶分离纯化：GAD提取液中加入(NH₄)₂SO₄至 30%饱和度，4℃静置 1h，冷冻离心去除部分杂蛋白，上清液加入(NH₄)₂SO₄至 50%饱和度，4℃静置 1h，冷冻离心弃去上清液，收集沉淀，沉淀溶于标准缓冲液，在标准缓冲液中透析至无 NH₄⁺，得到 GAD 粗酶液，冷冻干燥保存；采用 DEAE-Sephrose FF 阴离子交换柱对米胚 GAD 进行分离，控制米胚 GAD 的等电点在4.7 ；分离采用 50mmol/L、pH5.6、1.30mol/L NaCl 浓度的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱；再取一定量经上述离子交换色谱分离并透析除盐的米胚 GAD上Superdex 200 凝胶柱，用 pH5.6，含 1mmol/L PLP 和 1mmol/L PMSF 的 50mmol/L 磷酸钾缓冲液反复洗脱，即得分离纯化后的GAD。

本发明通过控制发芽条件，采用降低氧分压和低pH培养方式，采用含有Ca²⁺、H⁺的培养液，进行糙米发芽培养，使发芽糙米中富集GABA；采用蒸气灭酶技术，钝化发芽糙米中γ-氨基丁酸转氨酶（GABA-T）活性，提高GABA保存率的问题；采用低温干燥工艺，降低发芽糙米中的水分至安全含水量并能够达到产品较为疏松的结构，以利于后续的蒸煮糊化。以米糠、米胚芽作为GAD源，将其固定化后生产富集GABA的食品配料，并将其应用到GABA营养配合米粉生产中。加速开发富含GABA功能因子的食品材料，可作为或者用于抗高血压、增进脑机能及肝功能的功能食品。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图 1是本发明的流程示意图。

具体实施方式

实施例1：

（1）GABA(γ-氨基丁酸)制备：称取200g的糙米（糙米由稻谷砻谷并除杂制备）置于浅盘中，先用自来水冲洗一遍，洗去表面的杂质和灰尘，再加入4倍体积的水于25℃下浸泡3h。将浸泡后的糙米均匀地摊于铺有四层纱布的浅盘中，加入适量的水，盖上湿润的纱布，置于25℃下发芽24h并定时喷水。称取50g发芽糙米，加入200mL水用高速组织捣碎机磨成浆状，取一定量的糙米浆，在其中加入8.0mmol/L底物L-谷氨酸、0.2mmol/L辅酶PLP、 0.2mmol/L激活剂CaCl₂ ，在pH为6.1的PBS缓冲液中转化生成GABA，控制转化温度为37.5℃。

（2）GAD（谷氨酸脱羧酶）提取：称取100g的发芽糙米，加入50mmol/L磷酸缓冲液（pH5.7），0.5mmol/L维生素B₆，2mmol/L EDTA，0.2%的β-巯基乙醇，0.15mol/L NaCL的提取缓冲液研磨匀浆，定容至1000mL，静置提取2h后离心10min，上清液即为GAD 提取液。

（3）GAD（谷氨酸脱羧酶）分离纯化：酶提取液中加入(NH₄)₂SO₄至 30%饱和度，4℃静置 1h，冷冻离心去除部分杂蛋白。上清液加入(NH₄)₂SO₄至 50%饱和度，4℃静置 1h，冷冻离心弃去上清液，收集沉淀。沉淀溶于标准缓冲液（50mmol/L 磷酸钾缓冲液，pH5.6，1mmol/L PLP 和 1mmol/L PMSF）。在标准缓冲液中透析至无 NH₄⁺，得到 GAD 粗酶液，冷冻干燥保存。采用 DEAE-Sephrose FF 阴离子交换柱对米胚 GAD 进行分离，控制米胚 GAD 的等电点在 4.5。分离采用 50mmol/L、pH5.6、0.25mol/L NaCl 浓度的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱，再取一定量经离子交换色谱分离并透析除盐的米胚 GAD（蛋白质含量约为 5mg/ml）上Superdex 200 凝胶柱，用 pH5.6，含 1mmol/L PLP 和 1mmol/L PMSF 的 50mmol/L 磷酸钾缓冲液反复洗脱，即得分离纯化后的GAD。

实施例2：

（1）GABA(γ-氨基丁酸)制备：称取200g的糙米（糙米由稻谷砻谷并除杂制备）置于浅盘中，先用自来水冲洗一遍，洗去表面的杂质和灰尘，再加入4倍体积的水于30℃下浸泡6h。将浸泡后的糙米均匀地摊于铺有四层纱布的浅盘中，加入适量的水，盖上湿润的纱布，置于30℃下发芽36h并定时喷水。称取50g发芽糙米，加入200mL水用高速组织捣碎机磨成浆状，取一定量的糙米浆，在其中加入8.5mmol/L底物谷氨酸钠、辅酶PLP、 0.2mmol/L激活剂CaCl₂ ，在pH为6.2的PBS缓冲液中转化生成GABA，控制转化温度为38.0℃。

（2）GAD（谷氨酸脱羧酶）提取：称取200g的糙米，加入提取液 800ml（50mmol/L 磷酸钾缓冲液，pH5.6，2mmol/L 巯基乙醇，2mmol/L EDTA，1mmol/L PLP，1mmol/L PMSF 和 10%甘油），用高速分散器打成匀浆，四层纱布过滤，9000g 、4℃离心 25min，上清液即为米胚 GAD 提取液。

（3）GAD（谷氨酸脱羧酶）分离纯化：酶提取液中加入(NH₄)₂SO₄至 30%饱和度，4℃静置 1h，冷冻离心去除部分杂蛋白。上清液加入(NH₄)₂SO₄至 50%饱和度，4℃静置 1h，冷冻离心弃去上清液，收集沉淀。沉淀溶于标准缓冲液（50mmol/L 磷酸钾缓冲液，pH5.6，1mmol/L PLP 和 1mmol/L PMSF）。在标准缓冲液中透析至无 NH₄⁺，得到 GAD 粗酶液，冷冻干燥保存。采用 DEAE-Sephrose FF 阴离子交换柱对米胚 GAD 进行分离，控制米胚 GAD 的等电点在4.6。分离采用 50mmol/L、pH5.6、0.50mol/L NaCl 浓度的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱。再取一定量经离子交换色谱分离并透析除盐的米胚 GAD（蛋白质含量约为 5mg/ml）上Superdex 200 凝胶柱，用 pH5.6，含 1mmol/L PLP 和 1mmol/L PMSF 的 50mmol/L 磷酸钾缓冲液反复洗脱，即得分离纯化后的GAD。

 实施例3：

（1）GABA(γ-氨基丁酸)制备：称取200g的糙米（糙米由稻谷砻谷并除杂制备）置于浅盘中，先用自来水冲洗一遍，洗去表面的杂质和灰尘，再加入4倍体积的水于35℃下浸泡9h。将浸泡后的糙米均匀地摊于铺有四层纱布的浅盘中，加入适量的水,盖上湿润的纱布，置于30℃下发芽46h并定时喷水。称取50g发芽糙米，加入200mL水用高速组织捣碎机磨成浆状，取一定量的糙米浆，在其中加入9.0mmol/L底物谷氨酸钠、辅酶PLP、 0.2mmol/L激活剂CaCl₂ ，在pH为6.3的PBS缓冲液(含50mmol/L磷酸缓冲液（pH5.7），0.2mmol/L磷酸吡哆醛（PLP），2mmol/L EDTA，0.2%的β-巯基乙醇，0.15mol/L NaCL)中转化生成GABA，控制转化温度为38.5℃。

（2）GAD（谷氨酸脱羧酶）提取：称取100g的发芽糙米，加入50mmol/L磷酸缓冲液（pH5.7），0.5mmol/L维生素B₆，2mmol/L EDTA，0.2%的β-巯基乙醇，0.15mol/L NaCL的提取缓冲液研磨匀浆，定容至1000mL，静置提取2h后离心10min，上清液即为GAD 提取液。

（3）GAD（谷氨酸脱羧酶）分离纯化：酶提取液中加入(NH₄)₂SO₄至 30%饱和度，4℃静置 1h，冷冻离心去除部分杂蛋白。上清液加入(NH₄)₂SO₄至 50%饱和度，4℃静置 1h，冷冻离心弃去上清液，收集沉淀。沉淀溶于标准缓冲液（50mmol/L 磷酸钾缓冲液，pH5.6，1mmol/L PLP 和 1mmol/L PMSF）。在标准缓冲液中透析至无 NH₄⁺，得到 GAD 粗酶液，冷冻干燥保存。采用 DEAE-Sephrose FF 阴离子交换柱对米胚 GAD 进行分离，控制米胚 GAD 的等电点在4.7 。分离采用 50mmol/L、pH5.6、0.75mol/L NaCl 浓度的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱。再取一定量经离子交换色谱分离并透析除盐的米胚 GAD（蛋白质含量约为 5mg/ml）上Superdex 200 凝胶柱，用 pH5.6，含 1mmol/L PLP 和 1mmol/L PMSF 的 50mmol/L 磷酸钾缓冲液反复洗脱，即得分离纯化后的GAD。

 实施例4：

（1）GABA(γ-氨基丁酸)制备：称取200g的糙米（糙米由稻谷砻谷并除杂制备）置于浅盘中，先用自来水冲洗一遍，洗去表面的杂质和灰尘，再加入4倍体积的水于35℃下浸泡12h。将浸泡后的糙米均匀地摊于铺有四层纱布的浅盘中，加入适量的水,盖上湿润的纱布，置于35℃下发芽60h并定时喷水。称取50g发芽糙米，加入200mL水用高速组织捣碎机磨成浆状，取一定量的糙米浆，在其中加入9.5mmol/L底物谷氨酸钠、辅酶PLP、 0.2mmol/L激活剂CaCl₂ ，在pH为6.4的PBS缓冲液(含50mmol/L磷酸缓冲液（pH5.7），0.5mmol/L维生素B₆，2mmol/L EDTA，0.2%的β-巯基乙醇，0.15mol/L NaCL)中转化生成GABA，控制转化温度为39.0℃。

（2）GAD（谷氨酸脱羧酶）提取：称取200g的糙米，加入提取液 800ml（50mmol/L 磷酸钾缓冲液，pH5.6，2mmol/L 巯基乙醇，2mmol/L EDTA，1mmol/L PLP，1mmol/L PMSF 和 10%甘油），用高速分散器打成匀浆，四层纱布过滤，9000g 、4℃离心 25min，上清液即为米胚 GAD 提取液。

（3）GAD（谷氨酸脱羧酶）分离纯化：酶提取液中加入(NH₄)₂SO₄至 30%饱和度，4℃静置 1h，冷冻离心去除部分杂蛋白。上清液加入(NH₄)₂SO₄至 50%饱和度，4℃静置 1h，冷冻离心弃去上清液，收集沉淀。沉淀溶于标准缓冲液（50mmol/L 磷酸钾缓冲液，pH5.6，1mmol/L PLP 和 1mmol/L PMSF）。在标准缓冲液中透析至无 NH₄⁺，得到 GAD 粗酶液，冷冻干燥保存。采用 DEAE-Sephrose FF 阴离子交换柱对米胚 GAD 进行分离，控制米胚 GAD 的等电点在4.6 。分离采用 50mmol/L、pH5.6、1.00mol/L NaCl 浓度的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱。再取一定量经离子交换色谱分离并透析除盐的米胚 GAD（蛋白质含量约为 5mg/ml）上Superdex 200 凝胶柱，用 pH5.6，含 1mmol/L PLP 和 1mmol/L PMSF 的 50mmol/L 磷酸钾缓冲液反复洗脱，即得分离纯化后的GAD。

 实施例5：

(1) GABA(γ-氨基丁酸)制备：称取200g的糙米（糙米由稻谷砻谷并除杂制备）置于浅盘中，先用自来水冲洗一遍，洗去表面的杂质和灰尘，再加入4倍体积的水于40℃下浸泡12h。将浸泡后的糙米均匀地摊于铺有四层纱布的浅盘中，加入适量的水,盖上湿润的纱布，置于35℃下发芽72h并定时喷水。称取50g发芽糙米，加入200mL水用高速组织捣碎机磨成浆状，取一定量的糙米浆，在其中加入9.5mmol/L底物谷氨酸钠、辅酶PLP、 0.2mmol/L激活剂CaCl₂ ，在pH为6.5的PBS缓冲液(含50mmol/L磷酸缓冲液（pH5.7），0.2mmol/L磷酸吡哆醛（PLP），2mmol/L EDTA，0.2%的β-巯基乙醇，0.15mol/L NaCL)中转化生成GABA，控制转化温度为40.0℃。

（2）GAD（谷氨酸脱羧酶）提取：称取100g的发芽糙米，加入50mmol/L磷酸缓冲液（pH5.7），0.5mmol/L维生素B₆，2mmol/L EDTA，0.2%的β-巯基乙醇，0.15mol/L NaCL的提取缓冲液研磨匀浆，定容至1000mL，静置提取2h后离心10min，上清液即为GAD 提取液。

（3）GAD（谷氨酸脱羧酶）分离纯化：酶提取液中加入(NH₄)₂SO₄至 30%饱和度，4℃静置 1h，冷冻离心去除部分杂蛋白。上清液加入(NH₄)₂SO₄至 50%饱和度，4℃静置 1h，冷冻离心弃去上清液，收集沉淀。沉淀溶于标准缓冲液（50mmol/L 磷酸钾缓冲液，pH5.6，1mmol/L PLP 和 1mmol/L PMSF）。在标准缓冲液中透析至无 NH₄⁺，得到 GAD 粗酶液，冷冻干燥保存。采用 DEAE-Sephrose FF 阴离子交换柱对米胚 GAD 进行分离，控制米胚 GAD 的等电点在4.7 。分离采用 50mmol/L、pH5.6、1.30mol/L NaCl 浓度的磷酸钾缓冲液进行梯度洗脱。再取一定量经离子交换色谱分离并透析除盐的米胚 GAD（蛋白质含量约为 5mg/ml）上Superdex 200 凝胶柱，用 pH5.6，含 1mmol/L PLP 和 1mmol/L PMSF 的 50mmol/L 磷酸钾缓冲液反复洗脱，即得分离纯化后的GAD。

GABA生成量：935.58 mg/L;谷氨酸转化率：0.8351。