高含量GABA发芽糙米的制备工艺优化和GABA的提取纯化初探

摘要

发芽糙米(Germinated brown rice，GBR)是将糙米在一定温度和湿度环境中培养，待糙米发芽到一定程度时将米粒中的酶灭活，所得到的0.5-1 mm长的幼芽和带糠层的胚乳组成的大米制品，此时的米粒中，产生了大量精米中没有的营养物质，使具有特殊生理功能的活性物质含量显著增加，同时改善了糙米在食味品质上的不足。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种水溶性非蛋白质氨基酸，广泛存在于动植物体内，是高等动物神经系统内重要的抑制性传递物质，作为神经递质或神经递质的前体直接参与神经活动，同时参与多种机体代谢活动，具有很高的生理活性。糙米发芽过程中能产生大量的GABA，相比精白米，糙米发芽后GABA含量可以提高10倍，是人体从食物中获取GABA的一个重要来源。因此，研究如何通过优化糙米发芽的工艺条件来提高发芽糙米中的GABA含量，研究采用更精确的GABA测定方法，研究选用最佳的提取方法从发芽糙米中提取GABA并用阳离子交换树脂纯化GABA，具有十分重要的意义。
　　 由于GABA对电化学和紫外-可见光的不灵敏性，本文决定采用HPLC法来测定GABA含量。GABA是一种氨基酸，在巯基试剂3-巯基丙酸和碱性条件下，能与邻苯二甲醛OPA迅速反应生成1-硫代-2-烷基异吲哚加成物，该衍生物可以进行HPLC荧光或紫外测定含量。本文采用OPA柱前衍生，HPLC-UV338 nm检测发芽糙米中的GABA含量。同时利用HPLC检测的高度灵敏性，来精确分析不同方法如涡旋振荡提取和回流提取等提取GABA能力的差异，最终确定色谱柱为C18反相色谱柱，柱上保留时间为22 min。线性方程y=4.72×10-7x+3.95×10-3，回归系数R2=0.9991。GABA在线性范围0.02-0.2mg/mL内线性关系良好，平均回收率100.00％。用该法检测发芽糙米在不同提取条件下的GABA含量，得出用60％乙醇在37℃水浴振荡4 h可以得到最大的提取量。
　　 糙米在一定的条件下，经过筛选、清洗、消毒、浸泡、发芽、灭酶可以得到发芽糙米。因此发芽时的工艺条件，以及外源添加物的种类和浓度，对发芽糙米中各种物质的含量影响很大。本文分别研究了发芽过程中的浸泡温度、浸泡时间、浸泡pH、浸泡液中添加CaCl2浓度、发芽温度和发芽时间这六个因素对发芽后米粒中GABA含量的影响，同时使用筛选试验设计(Plackett-Burman，PB)设计从这六个因素中选取对发芽后GABA含量影响最关键的三个因子，分别为浸泡时间、浸泡液中氯化钙的浓度、发芽时间，并对这三个关键因子进行了中心组合实验设计(Central Composite Design，CCD)，优化糙米发芽得到高含量GABA的发芽条件。经过数据处理和分析，得到高含量GABA的发芽糙米的发芽工艺条件为：浸泡温度35℃，浸泡时间30 h，浸泡pH为5，浸泡液中CaCl2为2.12 mmol/L，发芽温度为25℃，发芽时间为12.15 h，预测最后得到的发芽糙米中GABA的含量为76.294 mg/100g。经过验证试验的验证，预测精确度达到了98.76％。
　　 GABA本身就是一种酸性物质，同时也带有碱性基团-氨基。在酸性环境中氨基结合一个质子而成阳离子状态，容易被树脂吸附；在碱性条件下羧基电离一个质子而带负电呈阴离子状态，从而使阳离子交换树脂的吸附量降低，因此本文采用强酸型732阳离子交换树脂法分离和纯化发芽糙米中的GABA可以很好的达到纯化GABA效果。流速影响吸附效果，流速越大，吸附效果越差，为了达到很好的吸附效果同时节约实验周期，本文采用选取上样流速为3 mL/min。样品粗提液的pH在酸性时，吸附效果显著，pH为碱性时，732强酸型阳离子交换树脂基本上不吸附GABA，本文采用上样液吸附pH为3。洗脱液的pH对GABA的洗脱结果起着很重要的作用，在碱性条件下洗脱效果明显优于酸性条件，本文采用pH为8～9时的洗脱液进行洗脱处理可以很好的达到洗脱阳离子交换树脂中的GABA。