公开/公告号CN102943114A
专利类型发明专利
公开/公告日2013-02-27
原文格式PDF
申请/专利权人 亚能生物技术(深圳)有限公司;
申请/专利号CN201210494686.5
申请日2012-11-28
分类号C12Q1/68(20060101);
代理机构44275 深圳市博锐专利事务所;
代理人张明
地址 518000 广东省深圳市宝安区西乡兴业路互联网产业基地三层
入库时间 2024-02-19 16:40:09
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-04-30
授权
授权
2013-03-27
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20121128
实质审查的生效
2013-02-27
公开
公开
技术领域
本发明属于生物技术与生物医药领域,具体涉及检测重型血友病A致病基因内含子22和内含子1倒位突变的试剂盒。
背景技术
血友病A(hemophilia A,HA)又称甲型血友病,是最为常见的X连锁隐性遗传性出血性疾病,其主要病因是由于凝血因子VIII(FVIII)基因突变而引起的FVIII含量不足或功能缺陷。HA患者常自发性或外伤性出血不止,出血可发生在任何部位,但以关节出血最为多见。反复多次关节出血可导致患者致残,甚至危及生命。临床上根据患者血浆FVIII促凝活性及症状严重程度将HA分为重型、中型和轻型,其中50%为重型。
我国HA的发病率在男性人群中约为1/5000。血友病根据所缺乏凝血因子的不同分为血友病A和血友病B(hemophilia B,HB),HA约占全部血友病的80%-85%,HB则约占15%-20%且在临床上通常为中型和轻型。HA的人群患病率无种族和地区差异,可能与较高的基因自发突变率相关。由于是X连锁隐性遗传,女性HA患者及其罕见。
FVIII基因全长186kb,位于X染色体长臂远端(Xq28),含有26个外显子和25个内含子,编码2351个氨基酸。随着人们对HA分子基础的认识不断深入,该病基因诊断的技术也得到了很大发展。截止2012年已经报道基因突变1400多种,主要是点突变、插入、缺失和倒位,其中内含子22倒位(Inversion 22,Inv22)突变约占全部重型血友病A的45%。1996年,Brinke等在一对同卵双生的重型HA双胞胎患者中第一次发现了FVIII基因第1号内含子倒位(Inversion1,Inv1)突变,在大样本重型HA患者中进行了该倒位的筛查,发现第1号内含子倒位是重型HA中仅次于第22号内含子倒位的突变热点。约50%的重型HA患者是由于内含子22倒位和内含子1倒位突变造成,这是近年来HA发病机制中重要的进展。
目前血友病规范化诊断已建立了包括临床诊断、家系调查、实验检测等系列技术平台。实验检测分为基因诊断和非基因间接诊断。目前市场上所有的血友病诊断产品均采用非基因间接诊断,包括活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆凝血酶原时间(PT)、血浆FVIII:C以及FVIII抗原检测等。这些产品可以对HA进行确诊,但无法确定HA患者的基因突变类型更无法检出携带者。因此,开发可以方便、准确诊断HA的基因分型产品,有效应用于产前诊断,对避免重型血友病胎儿出生,减低HA发病率具有重要意义。
Single tube PCR assay for detection of chromosomal mutations:application tothe inversion hotspot in the factor VIII gene including optional use of subcyclingPCR,该专利由Qiang Liu和Steven S Sommer发明,于2002年公开,专利号为US6355422B1。提出利用长距离PCR(Long Distance PCR,LD-PCR)法检测血友病A内含子22倒位突变。优势:一管PCR法,直接分型检测血友病A患者、携带者和野生型;缺限:成本高昂、耗时长、仅能检测内含子22倒位,检测系统不稳定,试剂需现用现配,无法作为临床检测产品应用。
由上海佰真生物技术有限公司申请,2011年公开,专利公开号为CN102230002A的中国发明:“血友病致病基因检测试剂盒及应用”公开的技术方案主要针对FVIII和FIX因子外显子区设计PCR和测序引物。优势:同时检测血友病A与血友病B致病基因,覆盖全长序列;缺陷:测序反应耗时长、成本高昂,70%-80%血友病A的FVIII基因突变呈高度异质性,突变形式复杂,测序结果难以分析。
目前,血友病A基因检测方法主要有:
LD-PCR法:长距离PCR,一般指扩增片断超过5kb的PCR方法,但反应体系无法满足稳定性和低成本要求。
Southern blot技术检测HA内含子22倒位,将待测的基因组DNA经限制性核酸内切酶消化后,琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,凝胶经碱处理使DNA变性,再将其从凝胶中印迹到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上,以放射性或非放射性标记的DNA探针与固相支持体上的DNA杂交,根据探针的标记特性用相应方法显示杂交条带,对待测DNA进行分析。操作复杂、灵敏度低,已很少使用。
反向PCR法检测HA内含子22倒位,利用限制性内切酶Bcl Ⅰ消化基因组后突变体片段存在差异,通过酶切产物进行自连,再利用PCR扩增,电泳分析。该方法耗时长达48h以上、操作复杂、对技术要求高,不适合开发产品。
直接测序(DS):通过DNA测序仪对FVIII全基因直接进行测序,找出基因突变的确切位置。但由于FVIII全基因片段很长,测序工作量大,时间长,限制了其在HA诊断上的广泛应用。
单链构象多态性(SSCP):通过PCR-单链构象多态性分析法检测小片段PCR产物<200bp,可筛查出点突变等的70%-95%。但当PCR产物片段>400bp时检出率不足50%,要保证检出率而使用小片段检测大大限制了此法在HA诊断上的应用。
变性梯度凝胶电泳(DGGE):利用野生型和突变型基因DNA在变性梯度凝胶过程中迁移率不同来检测基因突变,当检测片段<600bp时检出率可达95%。DGGE比SSCP可靠、精准、且检测片段较长。
变性高效液相色谱(DHPLC):通过分离柱进行突变DNA片段的分离和分析,对FVIII基因突变的检出率达96%。此法快速高效,易于自动化,被检片段可达1500bp,但费用昂贵,与SSCP、DGGE法一样需经测序才能确定突变的具体位置。
综上,现有技术中LD-PCR法由于反应体系无法满足稳定性和低成本要求,仅能检测内含子22倒位突变而无法开展广泛临床应用;测序法无法将结果分析与临床诊断进行有效结合;反向PCR法操作繁琐;SSCP仅适合检测点突变,DGGE和DHPLC操作繁琐、费用高昂、需测序确定突变的具体位置。
发明内容
本发明的目的是运用LD-PCR法快速灵敏地检测HA患者的FVIII基因内含子22和内含子1倒位,可检出50%的重型HA患者。
本发明的技术方案为提供一种重型血友病A致病基因突变检测试剂盒,所述试剂盒包括Inv22PCR反应液和Inv1PCR反应液;
1)所述Inv22PCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒 位的引物3条,分别为:
引物A22:SEQ ID NO:1;
引物B22:SEQ ID NO:2;
引物C22:SEQ ID NO:3;
2)所述Inv1PCR反应液包括检测重型血友病A致病基因内含子22基因倒位的引物3条,分别为:
引物1F:SEQ ID NO:4;
引物1R:SEQ ID NO:5;
引物2F:SEQ ID NO:6。
优选的,上述重型血友病A致病基因突变检测试剂盒中所述Inv22PCR反应液还包括Taq DNA聚合酶抑制剂,所述Inv1PCR反应液还包括Taq DNA聚合酶抑制剂。
优选的,上述重型血友病A致病基因突变检测试剂盒中所述Taq DNA聚合酶抑制剂为Taq-Antibody。
优选的,上述重型血友病A致病基因突变检测试剂盒中所述试剂盒还包括Inv22阳性参考品、Inv1阳性参考品和阴性参考品,所述Inv22阳性参考品为Inv22杂合子混合质粒,所述Inv1阳性参考品为Inv1杂合子混合质粒,所述阴性参考品为去离子水。
优选的,上述重型血友病A致病基因突变检测试剂盒中,所述的Inv22PCR反应液各组分含量为:
2×GC buffer:25μL;
10mM dATP、dCTP、dTTP的等体积混合液:2.0μL;
10mM dGTP:1.5μL;
10μM引物A22:1.25μL;
10μM引物B22:0.625μL;
10μM引物C22:0.625μL;
5U/μL LA taq DNA聚合酶:1.0μL;
5U/μL Taq-Antibody:1.0μL;
去离子水:11.5μL;
所述的Inv1PCR反应液各组分含量为:
10×PCR buffer:2.5μL;
2.5mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP的等体积混合液:4μL;
10μM引物1F:0.5μL;
10μM引物1R:0.5μL;
10μM引物2F:0.5μL;
5U/μL Hotstar Taq酶:1.0μL;
5U/μL Taq-Antibody:0.5μL;
去离子水:13.5μL。
本发明有益效果为:按照基因倒位原理,在FVIII基因内含子22和内含子1同源序列两端分别设计特异性引物,基因重组后,引物对发生交叉扩增,从而获得不同长度的扩增片段。本发明采用多重LD-PCR法开发高特异性的HA基因诊断产品。其优点如下:第一,解决Inv22长片断扩增稳定性、检测灵敏度、PCR产物量和电泳检测丰度的问题,提高对高GC片断的扩增效率、筛选dNTP浓度增强扩增特异性、筛选电泳条件提高检测PCR产物条带亮度;第二,通过添加Taq DNA聚合酶抑制剂解决试剂保存时间、温度耐受等问题,提高本发明的临床应用的稳定性。
附图说明
图1为本发明Inv22PCR产物电泳图;其中1:Inv22杂合突变,携带者;2:Inv22纯合突变,HA患者;3:wild type;4:Inv22阳性参考品;5:阴性参考品;
图2为本发明Inv1PCR产物电泳图;其中1:Inv1杂合突变,携带者;2:wild type;3:Inv1纯合突变,HA患者;4:Inv1阳性参考品;5:阴性参考品;6:Marker(2000bp,1000bp,750bp,500bp,200bp,100bp)。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、构造特征、所实现目的及效果,以下结合实施方式并配合附图详予说明。
现有技术中LD-PCR法由于反应体系无法满足稳定性和低成本要求、仅能检测内含子22倒位突变而无法开展广泛临床应用;本发明利用LD-PCR技术,同时检测重型血友病A内含子22和内含子1倒位突变,这两类突变覆盖50%的重型血友病A患者。通过添加保护剂,解决试剂稳定性问题;优化反应体系,降低试剂成本,使产品真正应用于临床,填补国内外血友病基因诊断产品空白。
在FVIII基因内含子22中有两个基因FVIIIA和FVIIIB,而X染色体远端另有两个与FVIIIA同源的基因。FVIIIA可与两个同源基因之一发生同源重组,从而使FVIIIA基因内含子22倒位至基因外远端。内含子1倒位分子机制与Inv22相似:在FVIII基因的1号内含子内int1h21序列和基因外远端int1h22序列同源性高达99.9%。Int1h21和int1h22发生基因重组后可形成两个嵌合的mRNA,FVIII基因转录被终止并与信号肽分离,导致FVIII蛋白合成与分泌失败。
按照基因倒位原理,在FVIII基因内含子22和内含子1同源序列两端分别设计特异性引物,基因重组后,引物对发生交叉扩增,从而获得不同长度的扩增片段。据此,采用多重LD-PCR法开发高特异性的HA基因诊断产品。本发明从两个角度进行开发,第一,解决Inv22长片断扩增稳定性、检测灵敏度、PCR产物量和电泳检测丰度,提高对高GC片断的扩增效率、增强扩增特异性并提高电泳检测分辨率;第二,为解决临床应用产品的稳定性,通过添加Taq DNA聚合酶抑制剂解决试剂保存时间、温度耐受等问题。
抑制剂在保存液状态抑制PCR反应液内Taq DNA聚合酶活性,在PCR反应开始后失活抑制剂,并恢复Taq DNA聚合酶活性,从而提高了Taq DNA聚合酶对环境温度耐受性。本发明选择的Taq DNA聚合酶抑制剂为Taq-Antibody(Ap),它是一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体,通过与Taq DNA聚合酶结合抑制酶活性,有效抑制引物二聚体的形成和非特异性扩增,同时增强了酶的温度耐受能力。
实施例1本发明试剂盒组成
本发明试剂盒特征包括Inv22PCR反应液、Inv1PCR反应液、Inv22阳性参 考品、Inv1阳性参考品、阴性参考品。
Inv22PCR反应包括Taq DNA聚合酶、PCR buffer、Deaza-dGTP、dNTP、引物和Taq-Antibody(Ap);
Inv1PCR反应液包括Taq DNA聚合酶、PCR buffer、dNTP、引物和Ap;
Inv22阳性参考品是含有Inv22PCR扩增产物全部片断的混合质粒;
Inv1阳性参考品是含有Inv1 PCR扩增产物全部片断的混合质粒;
阴性参考品的成分为ddH2O;
1、引物序列设计
根据已报道重型血友病A的FVIII基因倒位机制和序列,对相应引物进行了大量实践的筛选,包括增加或减少引物长度,并设计系列引物覆盖特异性区域,通过正交试验最终确定检测HA内含子22基因倒位引物3条,如表1所示,分别为A22,B22和C22;检测HA内含子1基因倒位引物3条,分别为1F、1R和2F。
表1
2、PCR反应液
2.1、Inv22PCR反应液成分
所述的HA的检测试剂盒基因Inv22PCR反应液中Taq DNA聚合酶选用LATaq(TAKARA生物技术有限公司)、GXL Taq(TAKARA),使用终浓度为0.5-10IU/反应;所述的PCR Buffer为GC buffer(TAKARA),终浓度为0.2倍-2倍;所述的Deaza-dGTP终浓度为1-10mM;所述的dNTP混合液的各组分终浓度为1-30mM;所述的Ap终浓度为0.1-5IU/反应;提取的基因组模板DNA浓度为10-200ng,通过正交设计实验验证,最终确认以下表2所示反应体系为最佳。
表2
2.2、Inv1 PCR反应液
所述的HA检测试剂盒的Inv1基因PCR反应液中Taq DNA聚合酶选用Hotstart Taq(QIAGEN)、Taq DNA聚合酶(TAKARA、PROMEGA和TIANGEN),使用终浓度为0.5-10IU/反应;所述的PCR Buffer为各酶相应Buffer,终浓度为0.2倍-2倍;所述的dNTP混合液各组分终浓度为1-30mM;所述的Ap终浓度为0.1-5IU/反应;提取的基因组模板DNA浓度为0.5-50ng,通过正交设计实验验证,最终确认以下表3所示反应体系为最佳。
表3
2.3、PCR反应程序
通过预变性、变性、延伸时间和温度梯度试验,优化反应条件,最终确定PCR扩增程序为:Inv22 PCR扩增程序如表4所示,Inv1 PCR扩增程序如表5所示。
表4
表5
3、电泳检测
采用0.6-0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,Inv22上样量为20μL,Inv1上样量为5μL。为获得清晰电泳条带,推荐使用电压低于3.5v/cm对Inv22 PCR产物进行电泳。
如图1和图2所示。采用0.6-0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测,Inv22野生型仅显示12kb条带,患者显示11kb条带,携带者同时显示12kb和11kb条带;Inv1野生型显示1.9kb条带,患者显示1.3kb条带,携带者同时显示1.9kb和1.3kb条带。
实施例2本发明试剂盒的使用
1、储存条件及有效期
储存条件:试剂盒置于-18℃以下保存
有效期:6个月
2、适用仪器
PCR仪(黑马9600),ABI9700等
3、样本要求
本试剂盒样本来源为抗凝全血,所用抗凝剂为枸橼酸钠或EDTA,不能使用肝素抗凝。
样本采集:抽取静脉血5mL,放入含有抗凝剂的管中,标记好样本的姓名和编号等样本信息。
血样保存:抗凝全血在室温放置不超过24小时,2-8℃保存不超过一个月,-18℃以下冰箱保存不超过两年,-70℃冰箱可长期保存,冷冻保存时应避免反复冻融。
血样运输:抗凝全血运输时需用冰壶或泡沫箱加冰袋密封,应保证冰袋不化冻,且在途时限不宜超过72小时。
4、检验方法
1.1、DNA获取
为保证基因组DNA的提取纯度,本发明试剂盒推荐使用QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒。
2、扩增试剂准备
从试剂盒中取出核酸扩增试剂置于室温融化并振荡混匀,2000rpm离心10sec。
设所需要的PCR反应管管数为n,n=待检样本数×2+1管阴性参考品+2管阳性参考品;
3、加样
向各PCR反应管中分别加入待检样本DNA、阴性参考品和阳性参考品DNA,盖紧管盖。短暂离心后置于PCR检测仪中并记录样本摆放顺序。
Inv22 PCR扩增程序如表6所示,Inv1 PCR扩增程序如表7所示。
表6
表7
电泳检测
采用0.6-0.8%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,Inv22上样量为20μL,Inv1上样量为5μL。为获得清晰电泳条带,推荐使用电压低于3.5v/cm对Inv22PCR产物进行电泳。
检验结果的解释
Inv22野生型仅显示12kb条带,患者仅显示11kb条带,携带者同时显示12kb和11kb条带;Inv1野生型仅显示1.9kb条带,患者仅显示1.3kb条带,携带者同时显示1.9kb和1.3kb条带。其他参考品显示如表8所示结果。
表8
实施例3本发明试剂盒与已有技术检测稳定性比较
本发明试剂盒通过添加Taq DNA聚合酶抑制剂来解决试剂保存时间、温度耐受等问题。选用已有Liu和Sommer的Inv22专利配方作为对照,专利号为US6355422B1。该专利利用长距离PCR法检测血友病A内含子22倒位突变,配方为常规PCR反应液,包括Taq DNA聚合酶、引物、dNTP、deaza-GTP和高浓度的DMSO。
本试验按照本发明实施例1所述试剂盒与Liu等发明专利配方,分别连续试生产三批产品对Inv22进行稳定性检测。本发明试剂盒批号为YN01、YN02和YN03,对照试剂批号为LS01,LS02和LS03。
1、试验方法
1.1、连续三批试生产产品稳定性试验
将本发明实施例1所述试剂盒保存于-18℃以下,自生产之日起,每1个月进行一次检测,连续检测6个月。本发明试剂盒按照实施例1所述方法进行PCR检测,对比专利试剂按其专利配方进行检测。分别检测5份Inv22杂合子、5份Inv22纯合子,对比试剂使用相同模板,模板量为50ng/反应,每个样本设三次重复。
1.2、加速破坏性试验
分别选取一批保存期内正常使用产品在37℃下保存1天、3天、5天和7天,并进行PCR检测,检测方法同1.1。
1.3、研究结果
1.3.1、稳定性试验
三批产品在指定条件下保存6个月的稳定性检测结果表明,本发明试剂盒在-18℃连续保存6个月,仍然可以稳定对Inv22进行检测,而对比试剂在相同条件下保存2个月时开始出现不稳定情况,Inv22杂合子基本不能扩增,3个月时完全无扩增,部分检测结果见表9。
表9
如表9为连续三批稳定性和破坏性试验结果,其中,“+”表示PCR正常扩增,“-”表示PCR检测无扩增
1.3.2、加速破坏试验
本发明试剂盒在37℃放置1天至7天均可稳定检出Inv22杂合子和纯合子,而对照试剂在3天时出现不稳定情况,5天完全无扩增,结果见表10。
表10
表10为加速破坏性试验结果,其中“+”表示PCR正常扩增,“-”表示PCR 检测无扩增
稳定和破坏性对比试验结果表明,本发明试剂盒的试剂配方提高了TaqDNA聚合酶的耐受能力,有效解决了LD-PCR扩增稳定性问题。
本发明试剂盒中Inv1检测反应体系在添加等比例的Taq DNA聚合酶抑制剂后,也可保证6个月效期,并在37℃放置7天后保持高扩增效率。
实施例4使用本发明试剂盒诊断临床样本中重型HA患者
利用本试剂盒检测临床样本50例,所有样本均采用金标准测序方法进行验证,检测结果见表11:使用本发明试剂盒检测临床样本中血友病A基因突变情况,统计分析对比结果见表表12:50例临床样本中各基因型测序结果和本试剂盒检测结果符合情况统计。
表11
本发明试剂盒检测50例临床样本和金标准测序结果对比,准确性为100%;本发明试剂盒检测50例临床样本结果和金标准测序结果对比分析统计,见表12。
表12
从表12可以看到50例临床样本中,本试剂盒检测范围内的Inv22纯合突变、Inv22杂合突变、Inv1纯合突变、Inv1杂合突变以及野生型均有存在,且本试剂盒检测准确性和特异性均在100%。
本发明试剂盒产品的性能指标:
1、灵敏度:本品能稳定检出的Inv22基因组DNA下限为30ng/反应;Inv1基因组DNA下限为2ng/反应;
2、准确性:本品检测FVIII基因Inv22和Inv1的准确性达100%;
3、特异性:本品检测FVIII基因Inv22和Inv1特异性达100%;
4、重复性:本品检测FVIII基因Inv22和Inv1重复性为100%;
5、稳定性:本品在有效期6个月内使用完全可满足以上各指标。
以上所述仅为本发明的实施例,并非因此限制本发明的专利范围,凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换,或直接或间接运用在其他相关的技术领域,均同理包括在本发明的专利保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110>亚能生物技术(深圳)有限公司
<120>重型血友病A致病基因突变检测试剂盒
<160>6
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
cctgcctgtc cattacactg atgacattat g 31
<210>2
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ccctacaacc attctgcctt tcactttcag tgcaat 36
<210>3
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
ccaaactata accagcacct tgaacttacc ctc 33
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
gttgttggga atggtta 17
<210>5
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ctagcttgag ctccctgtg 19
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
gcagggatct tgttggtaaa 。 20
机译: EGFR基因突变检测底物组,包含相同基因的EGFR基因突变检测试剂盒,以及用于执行EGFR基因突变检测的核酸扩增装置
机译: 致病性大肠杆菌检测载体,致病性大肠杆菌检测试剂盒和肠致病性大肠杆菌检测方法
机译: 基因突变检测试剂盒和基因突变检测方法