高活热稳定性纳豆激酶菌株及其发酵制品

摘要

本发明经辐照诱变得到了一株新的纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-T160。与野生菌BSNK-5相比，BSNK-T160的酪蛋白水解活性提高了46.9%，65℃热稳定性提高约8倍；相对于尿激酶的纤维蛋白活性提高了29.62%，热稳定性提高了82.31%。本发明得到的BSNK-T160菌株可用于生产高活、热稳定性纳豆激酶。用该新菌株发酵大豆24h便可产出纳豆，且所得纳豆品质优良。

说明书

技术领域：

本发明属于微生物领域，特别是涉及一种新的高活、热稳定性纳豆激酶生产菌株及其 在发酵生产纳豆及纳豆激酶方面的应用，本发明还涉及该菌株产生的发酵制品。

背景技术：

纳豆激酶（nattokinase，NK）是由纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus natto）分泌表达 的高效纤维蛋白溶解酶，最早从传统的日本大豆发酵产品纳豆中发现。与临床应用的溶栓 药物相比，具有溶纤活性高、安全可靠、无毒副作用、半衰期长、在胃肠道中稳定性好， 生产成本低廉等优点。

尽管国内外学者从不同的大豆发酵产品中分离和筛选出了一些高产纳豆激酶菌株，并 进行了优化发酵条件以提高纳豆激酶的产量、异源表达提高纳豆激酶的纯度、通过菌种选 育提高纳豆激酶的活力等研究，但对提高纳豆激酶热稳定方面的研究鲜有报道。

实践中真正可用于产业化生产纳豆激酶的菌株很少。特别是，由于纳豆激酶对热不稳 定，一直是限制该酶在保健食品、医药领域应用的瓶颈。

因此，得到高活性和热稳定性的纳豆激酶菌株需求十分迫切。

发明内容：

本发明的目的是提供新的高活、热稳定性纳豆激酶生产菌；本发明的直接目的是筛选 出一种新的纳豆枯草芽孢杆菌，使其可用于较大量生产纳豆及高活、热稳定性纳豆激酶。

本发明人通过800Gy⁶⁰Co-γ射线辐照诱变纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-5，采用酪蛋白平 板法经过多次点板传代反复筛选，结合65℃处理得到了高活、热稳定性突变菌株——纳 豆枯草芽孢杆菌（Bacillus natto）BSNK-T160，该新菌株已于2012年10月29日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6714。

本发明所述的纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-T160特征为：

形态特征：

菌株的菌落在LB平板上呈圆形，直径2-4mm，乳白色，不透明，边缘不整齐，表面 干燥，有皱褶，用接种环挑菌落有拉丝现象，菌落与培养基不结合，菌落正反面颜色相同。 显微镜下个体形态观察，菌株杆状，长3-4μm，宽0.8-1μm，两端钝圆，革兰氏染色呈 阳性，产芽孢，芽孢椭圆形，中生或近中生，见图1和图2。

培养特征：

BSNK-T160生长所用的培养基为LB培养基，辐照诱变所用的筛选培养基为酪蛋白培 养基，培养温度为30-37℃。

所述酪蛋白培养基的配方为：酪蛋白1%、酵母提取物0.5%、NaCl 0.9%、琼脂2%， pH7.2-7.4，121℃灭菌20min，现用现配。

本发明固体发酵所用的培养基为大豆，发酵温度为38-40℃。

由纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-T160发酵产生的发酵制品也属于本专利的的保护范围。 所述发酵制品可为发酵产品本身、经稀释过的发酵产品或经纯化的发酵产品；所述发酵制 品可采用颗粒、粉末、片剂等固体外形或是液体、糊状、胶状等流体外形。

发明效果：

经酪蛋白平板法筛选，纤维蛋白平板法检测筛选菌株的纤维蛋白溶解活性和热稳定 性，固体发酵验证菌体的发酵能力等实验证实：与野生型菌株BSNK-5相比，突变菌株 BSNK-T160具有以下有益效果：

1、提高了酪蛋白水解活性和热稳定性

在37℃的酪蛋白水解活性提高了46.9%，65℃热稳定性提高约8倍（图3）

2、提高了纤维蛋白溶解活性，特别是在65℃高温下的活性

纤维蛋白平板检测结果表明BSNK-T160在37℃的溶解圈面积增加了20.93%，相对于 尿激酶的活性提高了29.62%；65℃热处理后溶解圈面积增加了32.13%，相对于尿激酶的 活性提高了82.31%（图4）。

3、由纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-T160发酵产生的发酵制品质量好

固态发酵实验进一步证实接种BSNK-T160菌株24h后便在大豆表面形成一层白膜， 呈粘性，拉丝较长，所得纳豆颜色发黄，有金属光泽，具有酱香味（图5）。

本发明的BSNK-T160的优点如下：

1、较高的纤维蛋白水解活性；

2、较好的热稳定性；

3、发酵速度快，24小时就可发酵大豆产纳豆，大于市场纳豆菌发酵产纳豆最少需要 48h。

4、发酵所得纳豆品质好，没有氨臭味，具有酱香味。

因此，BSNK-T160菌株是理想的研究、应用的出发材料菌株。在纳豆激酶及纳豆的 生产领域中具有实现其产业化的极大可能，并具有广阔的医药、食品应用和市场前景。

附图说明：

图1为纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-T160的菌落形态图；

图2为纳豆枯草芽孢杆菌BSNK-T160的菌体形态图；

图3为不同温度处理后BSNK-T160的酪蛋白水解活性图；

图4为不同温度处理后BSNK-T160相对于尿激酶的活性图；

图5为BSNK-T160固体发酵产纳豆图。

生物材料保藏信息：

名称：纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus sutilis natto）BSNK-T160

保藏编号：CGMCC No.6714

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏时间：2012年10月29日。

具体实施方式

以下实施例仅用于举例说明本发明的方法，并不限制本发明的范围。

实施例1高活热稳定性突变菌株BSNK-T160筛选

1.材料

1.1菌种

BSNK-5，由发明人实验室从我国黑豆豆豉分离、筛选和鉴定的纳豆枯草芽孢杆菌。

1.2培养基

种子和液体发酵培养基：LB培养基；

筛选培养基：酪蛋白平板培养基。

1.3活力测定方法

酪蛋白平板法：将平板(9cm×9cm)放在水平仪上调水平,用10mM pH7.2PBS溶液配 制1%的琼脂糖,微波炉加热使之融化,加入pH8.9Tris-HCl缓冲液配制的等体积酪蛋白溶 液,使终浓度为3mg/ml,趁热倒入平板中,将气泡赶至边缘,室温下凝固。用直径5mm的打 孔器打孔,将待测样品点入孔内,37℃保温18h,小心取出平板,考马斯亮蓝染色,7%冰乙酸 脱色,酪蛋白被水解后,点样孔周围显示透明圈,其余部位为蓝色。

2方法

2.1菌悬液制备

从活化好的BSNK-5平板接单菌落到20ml LB液体培养基，30℃培养大约8-10h，到 OD600为0.8-1.0，取出，离心收集菌体（6000rpm，5min），生理盐水清洗2次，用等 体积生理盐水溶解，备用。

2.2 ⁶⁰Co-γ射线辐照诱变

取1ml上述菌液，加入9ml生理盐水，800Gy进行辐照诱变。将辐照诱变菌液进行倍 比稀释，取100μl涂酪蛋白平板，每个梯度涂10个酪蛋白平板，30℃过夜培养。

2.3高活菌株筛选

高活菌株初筛：随机选取照射后生长菌株点酪蛋白平板，以未经照射菌株为对照，30 ℃过夜培养。次日取出，选取正突变株（即酪蛋白平板溶解圈直径与菌落直径比值比对照 菌株溶解圈直径与菌落直径比值增大10%的菌株），重复点酪蛋白平板多次，进行溶解圈 观察。

高活菌株复筛：将最终确认稳定菌株经3ml LB液体培养基、30℃、220rpm培养5h， 取发酵液10μl点酪蛋白平板，30℃培养18h，计算溶解圈面积，选取诱变菌株溶解圈 面积比对照菌溶解圈面积增大10%的菌株进行热稳定性分析。

2.4热稳定性菌株筛选

将筛选菌株发酵液经37、55、60和65℃处理15min，酪蛋白平板检测活性，将热 处理后溶解圈面积比对照菌株大的菌株作为正突变菌株。

3结果

利用800Gy⁶⁰Co-γ辐照BSNK-5菌株，结合热处理，酪蛋白平板法筛菌得到活性和热 稳定提高菌株BSNK-T160（菌落与菌体形态见图1和2）。野生型菌株BSNK-5在37℃的酪 蛋白溶解圈面积为123.44mm2，突变菌株BSNK-T160为181.34mm2，活性提高了46.9%； 65℃处理15min后，突变菌株BSNK-T160酪蛋白平板的溶解圈面积仍为37.09mm2，而 BSNK-5的溶解圈面积为4.12mm2，热稳定性提高了8倍（图3）。

实施例2BSNK-T160纤维蛋白水解活性测定

1、活力测定方法

琼脂糖-纤维蛋白平板的配制

含有1%琼脂糖的pH7.2PBS溶液，50℃恒温水浴45min，加入凝血酶（最终活性 0.05IU/ml）和同样温度下水浴10min的等体积含有0.1%纤维蛋白原的pH7.2PBS溶液， 混匀。9cm×9cm的培养皿加入35ml此溶液，凝固后用直径5mm打孔器打孔，上样10ul， 37℃恒温培养18h，测量溶解圈的直径，计算溶解圈的面积，根据尿激酶标准曲线计算酶 的活力单位。

尿激酶标准曲线制作方法

尿激酶样品（100、200、300、400、500U/m1）各l0ul点样于新配制的纤维蛋白平板 上，放置10min，移入37℃培养箱，保温18h后取出，测定溶解圈的垂直直径，计算各溶 解圈面积。以溶解圈面积为横坐标，以酶活力为纵坐标作图，根据标准曲线计算样品活力。

发酵液制备方法

将BSNK-5与BSNK-T160经平板活化后，接入3ml LB液体培养基，30℃过夜培养。 次日取出，以2%的接种量接入20ml LB液体培养基，30℃、220rpm培养5h，离心取 发酵液10μl点纤维蛋白平板，37℃培养18h，用游标卡尺测量垂直直径，计算溶解圈 面积及相对于尿激酶的活力单位。

热处理方法同实施例1的2.4。

2、结果

纤维蛋白平板检测结果表明BSNK-5在37℃的溶解圈面积为194.09mm²，相对于尿激 酶的活性为289.53IU/ml；BSNK-T160溶解圈面积为234.72mm²，相对于尿激酶的活性为 375.28IU/ml；与BSNK-5相比，BSNK-T160纤维蛋白溶解圈面积增加了20.93%，相对于 尿激酶的活性提高了29.62%（图4）。

65℃热处理后，BSNK-5的溶解圈面积为93.42mm2，相对于尿激酶的活性为77IU/ml； BSNK-T160溶解圈面积为123.44mm2，相对于尿激酶的活性为140.38IU/ml；与BSNK-5 相比，BSNK-T160溶解圈面积增加了32.13%，相对于尿激酶的活性提高了82.31%（图4）。 实施例3BSNK-T160发酵生产纳豆

1、工艺流程

大豆原料一洗净—浸泡一蒸煮一接种一发酵一后熟一纳豆；取BSNK-T160菌株，按照 以上工艺试制纳豆。

2、方法

2.1菌悬液制备

从LB平板接BSNK-T160菌株到3ml液体培养基，37℃培养8-9h，2%的接菌量接入20ml LB液体培养基，37℃培养4-6h，离心收集菌体，生理盐水或无菌水清洗三次，重悬菌体， 用于固体发酵。

2.2大豆预处理

取50g大豆清洗，去除残渣及残次豆，加入100ml超纯水过夜浸泡，去除多余水分， 121℃高压灭菌20min。

2.3发酵

将灭好菌的大豆放凉置38-42℃，接入制备好的菌悬液，38℃培养24h,大豆表面有一 层白膜；停止发酵，放入4℃冰箱后熟12h。

2.4纳豆感官分析

BSNK-T160菌株经过以上工艺发酵大豆24h制得纳豆，成品色泽金黄，口感润滑，有 酱香味，用筷子挑起时有很长的拉丝样粘液物质，与市售纳豆风味十分相似（图5）。