人抗凝血酶制剂冷冻干燥过程中的保护剂

摘要

本发明公开了一种人抗凝血酶制剂冷冻干燥过程保护剂，保护剂由一种溶质蔗糖或氨基酸或其盐的一种用去离子水配制成保护剂溶液，所述的氨基酸或为赖氨酸或为其盐中的盐酸盐，或为酪氨酸或为其盐中的一种，或为天冬氨酸或为其盐中的一种，将其中一种溶质用去离子水配制成溶液，得到保护剂，在人抗凝血酶制剂冷冻干燥前加入保护剂后，可有效防止制剂在冷冻干燥过程中主要成分抗凝血酶的失活，保护抗凝血酶的活性存在，抗凝血酶制剂在冷冻干燥后有较好的制剂成形外观及复溶澄清度。

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，是人抗凝血酶制剂冷冻干燥过程，可有效防止制剂中主要成分抗凝血酶失活的保护剂。具体涉及，在抗凝血酶制剂中加入蔗糖或氨基酸或其盐类，可在冷冻干燥过程（-40℃至30℃）能有效保护抗凝血酶活性，提高抗凝血酶制剂的产率。

背景技术

人抗凝血酶（antithrombin，AT）是一种单链α₂糖蛋白，主要在肝脏中合成，由423个氨基酸组成，相对分子约58.2kD（千道尔顿），正常血浆中含量约150mg/l。抗凝血酶可抑制凝血酶、活化的凝血因子Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ的活性，占血浆抗凝血活性的70-85%，此外，其对血液中纤溶、激肽、补体系统也有一定的抑制作用，是一种多功能丝氨酸蛋白酶抑制剂。人体抗凝血酶活性缺乏，血栓形成风险增加。抗凝血酶缺乏可分先天遗传和获得性缺乏两种类型，先天性抗凝血酶缺乏是一种常染色体显性遗传病，其抗凝血酶活性水平为正常人的40-70%，其中有症状的患者，在欧美国家人群中比例约为1/2000-1/5000；获得性抗凝血酶缺乏症可由弥散性血管内凝血（DIC）、急性髓细胞样白血病、肾病综合征、溶血性尿毒性综合征、急性及慢性肝病、肠炎、血液透析、糖尿病等诱发。抗凝血酶缺乏患者，特别在妊娠过程、分娩或外科手术前后，需使用抗凝血酶制剂预防或治疗急性血栓的形成。截至目前，我国并没有成型的人抗凝血酶制剂上市，而使此类患者得不到有效治疗。

为了便于人抗凝血酶制剂的保存和运输，其通常采用粉针剂型，因此，在制备过程中需经过冷冻干燥过程。但在整个冷冻干燥过程中存在各种应力，包括低温应力、冻结应力（包括枝状冰晶的形成、离子强度增加、pH改变、相的分离等）及干燥应力（移去蛋白质表面单层水分子）等，这些应力通常是直接或间接导致蛋白质变性的因素。人抗凝血酶是具有生物活性的蛋白，为了维持其功能，在冷冻干燥过程通常需要添加一定量的保护剂，但至今未见有关蔗糖或赖氨酸或酪氨酸或天冬氨酸用于人抗凝血酶制剂冷冻干燥保护剂的文献及专利报道。

发明内容

本发明的目的是为了便于人抗凝血酶制剂的保存和运输，改善现有技术中人抗凝血酶制剂的冷冻干燥过程中，产生直接或间接导致蛋白质变性的问题，而提供一种人抗凝血酶制剂冷冻干燥过程中抗凝血酶制剂的保护剂。

本发明的技术方案为：

人抗凝血酶制剂冷冻干燥过程中的保护剂，保护剂的溶质包括蔗糖或氨基酸或其盐，所述的氨基酸或其盐为赖氨酸或其盐、酪氨酸或其盐、天冬氨酸或其盐，将上述物质的一种作溶质用去离子水配制成溶液得到保护剂溶液，在人抗凝血酶制剂冷冻干燥前加入人抗凝血酶制剂中。

上述的人抗凝血酶制剂冷冻干燥过程中的保护剂，其浓度是蔗糖的质量百分浓度为0.1-0.8%，赖氨酸或其盐的质量百分浓度为0.2-1.0%，酪氨酸或其盐的质量百分浓度为0.2-1.0%，天冬氨酸或其盐的质量百分浓度0.2-1.0%，所述的赖氨酸盐为赖氨酸盐酸盐；上述的各质量百分浓度均为加入保护剂后，各组分分别在制剂中最后的浓度。

本发明的有益效果为：

本发明提供的保护剂使抗凝血酶制剂在冷冻干燥过程（-40℃至30℃），抗凝血酶活性损失减少，回收率达86%以上，且冻干外观、复溶时间、复溶澄清度能够达到美国药典第32版（United States Pharmacopeia 32，USP32）和欧洲药典第7版（European Pharmacopoeia 7.0，EP7.0）的标准。在抗凝血酶制剂加入0.1-0.8%蔗糖，0.2-1.0%赖氨酸或其盐酸盐，0.2-1.0%酪氨酸或其盐，0.2-1.0%天冬氨酸或其盐中的一种就能在冷冻干燥过程中有效保护抗凝血酶的活性，提高抗凝血酶制剂的产率。

附图说明

图1是抗凝血酶制剂冷冻干燥过程温度与时间变化曲线。

说明：在图1中横坐标代表冷冻干燥过程的时间（小时，h），纵坐标代表冷冻干燥过程中的温度（℃），曲线代表随着冷冻干燥时间的推移冷冻干燥机冷冻干燥箱体内的温度变化。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明的保护剂在抗凝血酶制剂冷冻干燥过程中的作用作详细说明， 

1.抗凝血酶的提取

Cohn 氏法血液制品组分IV沉淀，柠檬酸钠和NaCl溶液25℃条件抽提60min，抽提液6000rmp条件离心40min，取上清液；上清液0.80μm和0.45μm膜过滤，滤液经亲和层析，得到洗脱液，再经超滤除盐及浓缩，得到抗凝血酶浓缩物（≥6.0IU/mg）。

2.加入冻干保护剂，制备抗凝血酶冻干制剂

25-37℃条件，用去离子水，按质量百分比，配制浓度为4-16%的蔗糖、或赖氨酸盐酸盐，或酪氨酸，或天冬氨酸溶液，测定并用0.1mol/L-1mol/L的HCl或NaOH溶液调pH至6.0-7.5；根据所需保护剂终浓度和抗凝血酶浓缩物的量添加保护剂，

例如：抗凝血酶制剂所需蔗糖保护剂最终质量百分浓度为0.4%，配制蔗糖溶液质量百分浓度为10%，抗凝血酶制剂质量为200g，则称取8.3333g质量百分浓度为10%的蔗糖溶液与200g抗凝血酶制剂混合均匀；

再例如：抗凝血酶制剂所需天冬氨酸保护剂终质量百分浓度为0.8%，配制天冬氨酸溶液质量百分浓度为6%，抗凝血酶制剂质量为500g，则称取76.9231g质量百分浓度为6%的天冬氨酸溶液与500g抗凝血酶制剂混合均匀。保护剂添加后除菌、分装，-40℃至30℃条件冷冻干燥。

3.冷冻干燥后制剂成形外观观察

冷冻干燥后抗凝血酶制剂成形外观结果见表1。

 

表1 不同保护剂抗凝血酶制剂成形外观

由表1可看出，添加保护剂的制剂，经冷冻干燥后，其成形外观较好。

4.冷冻干燥后制剂复溶时间及复溶后澄清度观察

室温条件下，注射用水溶解制剂，观察其复溶时间，室温放置20min后观察澄清度，结果见表2。

 

表2 不同保护剂抗凝血酶制剂复溶时间及复溶后澄清度

由表2可看出，添加保护剂的制剂，在60秒内均能完全溶解，且室温放置20min后，溶液澄清，而未加保护剂空白对照有颗粒状不溶物，说明本发明保护剂能有效保护抗凝血酶。

5.冷冻干燥后制剂中抗凝血酶活性收率

检测冷冻干燥前后制剂中抗凝血酶活性。冷冻干燥后抗凝血酶活性收率结果见表3。

 

表3不同保护剂冷冻干燥后抗凝血酶活性收率

由表3可看出，未添加保护剂的制剂，经冷冻干燥后抗凝血酶活性收率不超过75%，而添加保护剂的制剂，抗凝血酶活性收率不低于86%，说明本发明保护剂能有效保护抗凝血酶的活性。

综上所述，本发明为抗凝血酶制剂的冷冻干燥过程提供了有效的保护剂。

以上结合实施例对本发明进行了描述。本发明的保护范围不限于此，任何本技术领域人员在本发明披露的技术范围内，所得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。