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谷氨酸氧化酶突变体、双酶共表达载体及其应用

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本发明公开了一种通过对L‑谷氨酸氧化酶进行定点突变，获得一种酶活明显提高的谷氨酸氧化酶突变体，共表达该突变体酶和过氧化氢酶构建重组工程菌株，以L‑谷氨酸盐为底物，在常温常压条件下制备α‑酮戊二酸。本发明所采用的工艺简单，具有高转化率、易分离纯化、生产条件温和、环境污染小等特点，具有较好的工业化应用前景。

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公开/公告号CN110283800A

专利类型发明专利
公开/公告日2019-09-27

原文格式PDF
申请/专利权人中国科学院天津工业生物技术研究所;
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申请/专利号CN201910787949.3
发明设计人刘君;徐宁;周威;
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申请日2019-08-26
分类号
代理机构北京知元同创知识产权代理事务所(普通合伙);
代理人刘元霞
地址 300308 天津市滨海新区空港经济区西七道32号
入库时间 2024-02-19 13:17:43

法律信息

法律状态公告日

法律状态信息

法律状态
2019-11-05

授权

授权
2019-10-29

实质审查的生效 IPC(主分类):C12N9/06 申请日:20190826

实质审查的生效
2019-09-27

公开

公开

说明书

技术领域

本发明涉及一种谷氨酸氧化酶突变体、双酶共表达载体及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

α-酮戊二酸（α-KG）是一种重要的有机酸，在有机体细胞代谢中发挥着重要作用，也是合成多种糖类、氨基酸以及蛋白质等的重要前体物质，在食品、医药、饲料、化工和化妆品等行业中具有广阔的应用前景。近年来，α-KG广泛应用于运动营养饮料和保健品，α-KG经人体消化吸收后，体内过多的氨可以结合到α-KG上以减少氨中毒带来的问题，同时参与体内氮代谢等代谢过程。此外，α-KG也可作为体格增强剂，与鸟氨酸结合后，能提高生长激素、胰岛素的水平，而且可抑制肌纤维的分解、在减少蛋白质消耗的前提下起到修复肌肉损伤的作用, 具有较高的保健价值。

目前，α-KG的生产方法包括化学合成法、微生物发酵法和生物催化法。传统α-KG生产采用化学合成法，但化学合成工艺中所使用的强酸强碱、氰化物等有害试剂，不仅容易引起环境污染，更限制了其在食品、化妆品和医药等行业的应用。微生物发酵法发酵周期长，且发酵产物中丙酮酸、富马酸等副产物较多，会增加后续α-KG提取的难度和费用，尚未实现工业大规模生产。酶法生产α-KG具有反应周期短、转化率高等优势，牛盼清等通过诱变获得高产谷氨酸氧化酶的链霉菌突变株，在最优条件下转化24 h，α-KG产量可达38.1 g/L（牛盼清, 等. 生物工程学报, 2014, 8: 1318-22）；利用基因工程的方法，将谷氨酸氧化酶基因在大肠杆菌中异源表达，通过酶法催化，24 h生成α-KG产量104.7 g/L（Niu PQ, et al. JBiotechnol, 2014, 179:56-62）。利用纯化酶进行体外催化不仅需要经过繁琐的蛋白纯化步骤，而且反应过程中需外源添加大量昂贵的过氧化氢酶辅助催化，大大增加了工业成本。相比分离酶进行体外催化，全细胞生物催化剂更容易制备，催化性能更加稳定，不易受外界温度、pH等因素的影响；转化过程中不需外源添加辅助因子，且无有毒有害产物的生成，环境友好，具有工业化应用前景。

谷氨酸氧化酶 (L-glutamate oxidase, LGOX) 是一种以黄素腺嘌呤二核苷酸为辅基的黄素蛋白酶类，具有高度的底物立体异构选择性，催化效率高，反应条件温和，能在不添加外源性辅助因子的条件下氧化L-谷氨酸生成过氧化氢、氨和α-酮戊二酸。研究发现，该酶主要存在于链霉菌中，但产酶能力相差较大。发掘和鉴定具有高活性或底物特异性的谷氨酸氧化酶，并获得符合生理研究和生产应用要求的酶催化体系，将为工业生产α-KG提供有利条件。

发明内容

本发明的目的在于利用基因工程手段对微生物来源的L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶进行共表达优化，构建出了催化性能优良的共表达重组菌株，并使用该菌株建立了高效生产α-KG的全细胞转化方法，如图1所示。

本发明的一个目的在于提供一种酶活提高的谷氨酸氧化酶突变体，是将对应于SEQ ID NO:1的第280位氨基酸由丝氨酸S突变为苏氨酸T的氨基酸序列；或者所述谷氨酸氧化酶突变体是进一步包括在对应于SEQ ID NO:1的第533位氨基酸由组氨酸H突变为亮氨酸L的双位点突变的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述谷氨酸氧化酶突变体包括如SEQ IDNO:5所示的氨基酸序列，所述谷氨酸氧化酶突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；在另一个实施方案中，所述谷氨酸氧化酶突变体包括如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列，所述谷氨酸氧化酶突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。本发明所述谷氨酸氧化酶突变体编码核苷酸序列可以是来源于SEQ ID NO:2所示的野生型的L-谷氨酸氧化酶编码核苷酸序列，例如所述突变体的编码核苷酸序列可以是SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列经突变或特定位点的核苷酸被取代而得到。

在一个实施方案中，所述野生型L-谷氨酸氧化酶来源于茂源链霉菌（Streptomyces>）。

在一个实施方案中，所述谷氨酸氧化酶突变体的氨基酸序列还可以包括1-10个其他氨基酸残基的取代、缺失或插入，但仍然保持L-谷氨酸氧化酶活性。

本发明还提供表达上述谷氨酸氧化酶突变体的重组菌株，是将所述突变体的编码核苷酸序列或含有所述编码核苷酸序列的载体导入宿主菌株所得到。所述重组菌株可用于生产α-酮戊二酸。

本发明的第二个目的在于提供一种生产α-KG的双酶共表达载体，所述共表达载体是在一个质粒中同时导入L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的编码基因。

根据本发明，所述L-谷氨酸氧化酶来源于链霉菌属，所述过氧化氢酶来源于肠杆菌属。根据本发明，所述用于双酶共表达的载体种类没有特殊限定，可以为能够在菌株中表达目的基因的本领域常用的各种表达载体，例如大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭表达质粒pXMJ19，或pDXW系列载体，或pBL1系列载体，或大肠杆菌表达质粒pET系列载体, 或pBAD系列载体，或枯草芽孢杆菌表达质粒pHT01，或pMA5载体等，在优选的实施方式中所述表达载体为pXMJ19质粒。在一个实施方案中，所述L-谷氨酸氧化酶含有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。在另一个实施方案中，所述L-谷氨酸氧化酶是如第一目的所述的谷氨酸氧化酶突变体，所述突变体的氨基酸如SEQ ID NO:5或SEQID NO:7所示，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8所示。

在一个实施方案中，所述双酶共表达载体中过氧化氢酶含有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，其编码核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明提供了多种单质粒双酶共表达体系，在一个质粒中同时表达L-谷氨酸氧化酶的编码基因和过氧化氢酶的编码基因。在一个实施方案中，所述双酶共表达载体是采用单启动子模式将一个启动子和所述L-谷氨酸氧化酶的编码基因以及过氧化氢的编码基因进行串联表达，所述两种编码基因可以任意顺序串联；在另一个实施方案中，所述双酶共表达载体是采用双启动子模式，分别在L-谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的编码基因前分别添加启动子。所述启动子可以为tac强启动子或者trc强启动子。在一个实施方案中，优选单启动子模式，且启动子为tac强启动子。

在本发明的实施方案中，在单启动子模式中，两个编码基因之间可以增加保守型RBS相关序列进行分割；或者在双启动子模式中，启动子和编码基因之间分别增加RBS相关序列。

在一个具体实施方案中，采用单个tac强启动子将L-谷氨酸氧化酶编码基因和过氧化氢编码基因进行串联表达，其中L-谷氨酸氧化酶编码基因和过氧化氢酶编码基因间由保守性RBS相关序列所分割；在另一个具体实施方案中，采用双启动子模式分别在L-谷氨酸氧化酶编码基因和过氧化氢酶编码基因前添加tac强启动子和保守性RBS相关序列；在又一个具体实施方案中，采用双启动子模式在L-谷氨酸氧化酶编码基因前添加tac强启动子和保守性RBS相关序列，在过氧化氢酶基因前添加trc强启动子和保守性RBS相关序列。

本发明用于共表达体系构建的启动子和RBS相关序列为：

本发明的第三个目的在于提供一种生产α-KG的双酶共表达重组菌株，所述重组菌株含有如第二目的所述的双酶共表达载体。在一个实施方案中，所述重组菌株是将所述双酶共表达载体转化或导入宿主菌株所得。本发明的宿主菌株是可以表达所述谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的菌株，所述宿主菌株可以选自棒杆菌属、埃希氏菌属或者芽孢杆菌属，例如为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium>）、大肠杆菌（Escherichia>）或枯草芽孢杆菌（Bacillus>）；优选为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium>），更优选为谷氨酸棒杆菌ATCC 13032。

本发明的第四个目的在于提供一种全细胞催化菌泥，所述菌泥包括第三目的所述的双酶共表达重组菌株；具体地，将所述重组菌株通过高密度液体深层发酵制备。

在一个实施方案中，所述全细胞催化菌泥采用如下方法制备得到：

（1）将第三目的所述的共表达重组菌株接种于种子培养基培养；

（2）随后将种子液接种于发酵培养基发酵，任选地添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白表达，收集菌体细胞，得到所述全细胞催化菌泥。

在一个具体的实施方案中，所述全细胞催化菌泥的制备方法如下：

将所述的共表达重组菌株接种于含有100 mL种子培养基（酵母粉 2.5 g/L，蛋白胨 5g/L， NaCl 5 g/L，脑心浸液 18.5 g/L，山梨醇 91 g/L）的500 mL三角瓶中，于30°C振荡培养15-18 h；按照5%接种量转接于已经装有5 L发酵培养基（葡糖糖 100 g/L，玉米浆 15 g/L，硫酸铵 20 g/L，硫酸镁 1 g/L，磷酸二氢钾 0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.1 g/L，柠檬酸钠 2g/L，碳酸钙 2 g/L；pH 7.0）的发酵罐中，设定培养温度30~32°C，控制培养pH值为7.0，培养前期控制转速为300 r/min，当溶氧降至20 %以下，设置转速与溶氧偶联。待菌体浓度OD₆₀₀生长至约25~30时，添加终浓度为0.4>600可达150.0左右。待整个诱导过程完成后，将上述发酵培养物进行离心，收集菌体细胞，即得全细胞催化菌泥。

本发明的第五个目的在于提供上述谷氨酸氧化酶突变体、双酶共表达载体、重组菌株或全细胞催化菌泥在制备α-酮戊二酸中的应用。

本发明的第六目的还提供一种全细胞催化制备α-酮戊二酸的方法，包括培养第三目的所述的双酶共表达重组菌株。

在一个实施方案中，是在水相发酵体系中加入谷氨酸钠一水合物，加入上述重组菌株或者含有所述重组菌株的全细胞催化菌泥重悬，进行催化反应。任选地，在催化反应中加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白表达。作为一个优选的实施方案，本发明采用全细胞催化方法制备α-酮戊二酸，无需再加入外源性的酶催化剂。

在具体实施方案中，所述发酵体系中优选谷氨酸钠一水合物（味精）的终浓度为270 g/L。在一个实施方案中，发酵体系中所述全细胞催化菌泥的浓度为10~20 g/L，例如为12 g/L、15 g/L、18 g/L。在一个实施方案中，控制转速为400 r/min，设置溶氧为25~40%，反应温度为35°C，催化反应时间为24~48 h。

本发明中术语“对应于”具有本领域普通技术人员通常理解的意义。具体地说，“对应于”表示两条序列经同源性或序列相同性比对后，一条序列与另一条序列中的指定位置相对应的位置。因此，例如，就“对应于SEQ ID NO:1第280位氨基酸由丝氨酸S突变为苏氨酸T”而言，如果在SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的一端加上6×His标签，那么所得突变体中对应于SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的第280位就可能是突变体的氨基酸序列中第286位。本领域普通技术人员可以采用本领域已知的任何测定序列同源性或相同性的方法测定或比较序列的同源性或相同性，包括但不限于计算机分子生物学(Computational MolecularBiology)，Lesk，A.M. 编，牛津大学出版社, 纽约, 1988; 生物计算: 信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and Genome Projects), Smith，D.W. 编, 学术出版社,纽约, 1993; 序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data), 第一部分, Griffin, A.M. 和 Griffin, H.G. 编, Humana Press, 新泽西, 1994等文献中所记载的方法。

本发明的有益效果

本发明成功构建了一种高效共表达谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶的重组工程菌株，并提供了一种不需外源添加过氧化氢酶的α-酮戊二酸生物制备方法，该方法具有较高的底物转化率且副产物较少，制备方法简单方便，生产条件温和、环境污染小，具有很好的技术应用前景。本发明使用的L-谷氨酸氧化酶的催化性能优良，能够高效的催化底物L-谷氨酸生成α-酮戊二酸，本发明使用的过氧化氢酶，能够将催化反应中产生的过氧化氢副产物快速降解，从而促进α-酮戊二酸生产。本发明可以优选公认的食品安全级微生物谷氨酸棒杆菌作为生产菌株，该菌株作为传统的主要工业发酵微生物，用于生产味精已有数十年的历史，因此使用该菌生产α-酮戊二酸可以有效避免食品安全隐患。

附图说明

图1是基于全细胞催化生产α-酮戊二酸示意图。

图2是共表达重组菌株全细胞可溶性总蛋白SDS-PAGE电泳图。

图3是谷氨酸氧化酶突变体活性分析。

图4是全细胞催化液中α-酮戊二酸含量分析检测图。

具体实施方式

下面的实施进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。以下实施例中，大肠杆菌DH5α和谷氨酸棒杆菌均可市售获得，大肠杆菌DH5α用于本发明中所有基因的克隆，谷氨酸棒杆菌用于本发明中基因蛋白表达及全细胞转化生产α-酮戊二酸。大肠杆菌DH5α感受态细胞与谷氨酸棒杆菌感受态细胞按照常规方法制备。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学试剂的制造厂商所建议的条件。

实施例1 谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶共表达载体的构建

本领域技术人员应该理解的是，谷氨酸棒杆菌与茂源链霉菌等在表达蛋白质时，都表现有不同程度的密码子偏爱性。将来自茂源链霉菌的谷氨酸氧化酶基因进行密码子优化，可以使目标蛋白在谷氨酸棒杆菌表达系统中更有效地表达，所述密码子优化的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

本发明将来自茂源链霉菌（S.> DSM40903）的谷氨酸氧化酶基因按照谷氨酸棒杆菌的密码子使用频率进行优化，核苷酸序列如SEQ ID No:2所示，委托苏州金唯智生物科技有限公司进行基因合成，并以Lgox-5F和Lgox-3R为引物对，通过PCR扩增获得起始密码子前端已添加保守性RBS相关序列的谷氨酸氧化酶基因序列。以rbs-katE-5F和rbs-katE-3R为引物对，以大肠杆菌（E.> MG1655）基因组为模板，通过PCR扩增获得起始密码子前端已添加保守性RBS相关序列的过氧化氢酶基因序列。以上述两段基因序列为模板，并以Lgox-5F和rbs-katE-3R为引物，通过搭桥PCR扩增获得已经分别添加RBS序列的谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶融合片段（rbs-lgox-rbs-katE）。以pXMJ19-5F和pXMJ19-3R为引物对，质粒pXMJ19为模板，通过PCR获得含有AarI酶切位点的pXMJ19质粒骨架。采用基于GoldenGate 克隆的片段装配方法，将融合片段rbs-lgox-rbs-katE和pXMJ19质粒骨架连接成单启动子串联表达质粒。将上述所获重组质粒命名为pXMJ19-tac-lgox-katE，并送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序确认。

选用pXMJ19-tac-lgox-katE质粒为模板，利用pXMJ19-lk-5F和pXMJ19-lk-3R引物对，通过PCR获得含有AarI酶切位点的pXMJ19-tac-lgox-katE质粒骨架。将tac-fusionF和tac-fusionR引物进行退火后融合后形成含有粘性末端的双链DNA片段，即tac启动子序列；将trc-fusionF和trc-fusionR引物进行退火后融合后形成含有粘性末端的双链DNA片段，即trc启动子序列。将质粒骨架经过AarI内切酶处理后，分别与上述获得的tac启动子序列和trc启动子序列进行连接，分别获得两种双启动子表达质粒pXMJ19-tac-lgox-tac-katE和 pXMJ19-tac-lgox-trc-katE，将所获质粒送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序确认。

上述实施案例中所用引物序列为：

在本实施例中， PCR扩增反应体系为：10 μL 5 × HF Phusion buffer，2.5 μL 2.5mM dNTP，2.5 μL 10 μM Primer 1，2.5 μL 10 μM Primer 2，0.5 μL Template，0.5 μLDMSO，0.5 μL Phusion DNA聚合酶，补充ddH₂O至50>

在本实施例中， Golden Gate组装体系为：1.5 μL 10 × T4 Ligase buffer，1 μL T4 Ligase，1 μL AarI内切酶，0.5 μL 100 × BSA，0.2 μL Oligo，200 ng 基因片段或质粒骨架，补充ddH₂O至15>

在本实施例中，酶切体系为：5 μL 10 × FastDigest buffer，2 μL AarI内切酶；0.5 μL 100 × BSA，200 ng DNA片段，补充ddH₂O至50>

本实施例选取的表达载体pXMJ19为诱导表达型载体，该质粒本身含有强启动子tac相关序列（包括操纵序列lacO），当加入IPTG或乳糖等诱导物时，会促使阻遏蛋白离开操纵序列从而起始基因表达。

实施例2 谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶共表达重组菌株构建和表达分析

提取上述实施例1中所获的共表达质粒pXMJ19-tac-lgox-katE、pXMJ19-tac-lgox-tac-katE和pXMJ19-tac-lgox-trc-katE，采用电转化法将其转入谷氨酸棒杆菌，所述具体转化方法为：取100 μL谷氨酸棒杆菌感受态细胞，分别加入约200 ng 上述共表达质粒，充分混匀后转移到已预冷2 mm电转杯中并在冰上放置20 min，调节电转仪电压为2.1 kV进行电激，完成后立即于加入1 mL LBHIS液体培养基，置于46°C水浴锅热激6 min，在32°C、150rpm摇床复苏培养2 h后，涂布含有15 μg/mL氨苄青霉素的LBHIS固体培养基，32°C过夜培养，待生长出单菌落后进行验证。

将上述获得的含有不同共表达质粒的重组谷氨酸棒杆菌进行蛋白诱导表达检测，分析谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶表达情况。具体方法为：分别挑取单克隆接种于含有100mL LBHIS液体培养基的摇瓶中，在32°C，200 r/min摇床中过夜培养。随后，按照2%接种量将过夜菌重新转接于100 mL LBHIS液体培养基中，在32°C，200 r/min摇床中培养至菌体浓度OD₆₀₀至1.0左右，添加终浓度为0.4>

如图2所示，蛋白表达分析发现，pXMJ19-tac-lgox-tac-katE共表达菌株中过氧化氢酶表达量明显高于谷氨酸氧化酶，表明在过氧化氢酶编码基因前添加tac启动子有助于基因表达；pXMJ19-tac-lgox-trc-katE共表达菌株中，过氧化氢酶表达量却出现明显下降，提示该trc启动子不适用于双酶共表达系统；pXMJ19-tac-lgox-katE共表达菌株中谷氨酸氧化酶和过氧化氢酶都有相对较高的表达水平，两者蛋白浓度基本类似。

实施例3 高密度发酵培养制备全细胞催化用菌泥

本实施例用于提供一种共表达重组菌株的高密度发酵培养和菌泥制备方法，所述发酵培养的方法可以包括以下步骤：将上述实施例2中获得的共表达重组菌株接种至已含有氯霉素抗性的种子培养基中，在32°C，200 r/min摇床中震荡培养16 h，获得共表达重组菌株种子液；按照5%接种量将种子液接种于已装有5 L发酵培养基的发酵罐中，设定培养温度32°C，搅拌转速300 r/min，控制培养pH值为7.0，当溶氧降至20%以下时，设置转速与溶氧偶联。监测菌体浓度OD₆₀₀，待菌体生长至OD₆₀₀约为25时，添加终浓度为0.4>600可达150.0左右；将上述液体发酵培养物在转速8000×g条件下离心10>

本领域技术人员应该理解的是，种子培养基和发酵培养基中加入的抗生素作为筛选标记用于共表达重组菌株的发酵培养，所述抗生素的浓度没有特别的限制，工作浓度为15 μg/L。在本实施例中，所述种子培养基的组分为：酵母粉 2.5 g/L，蛋白胨 5 g/L， NaCl5 g/L，脑心浸液 18.5 g/L，山梨醇 91 g/L；所述发酵培养基的组分为：葡糖糖 100 g/L，玉米浆 15 g/L，硫酸铵 20 g/L，硫酸镁 1 g/L，磷酸二氢钾 0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.1 g/L，柠檬酸钠 2 g/L，碳酸钙 2 g/L，调整培养基至pH 7.0。在本实施例中对培养基pH的调节，所使用的酸碱溶液及浓度没有特别的限制，本实施例采用酸溶液为50%醋酸，碱溶液为50%氨水。

实施例4 建立全细胞转化工艺制备α-酮戊二酸

本实施例用于提供一种全细胞转化生产α-KG方法，基于上述实施例2中构建的共表达重组谷氨酸棒杆菌为全细胞催化剂，建立α-KG的生物制备工艺。所述α-KG的生产方法具体是利用发酵罐建立5 L全细胞催化体系，添加270 g/L终浓度的谷氨酸钠一水合物（味精）底物，加入10 g/L上述实施例3中制备的全细胞菌泥，控制发酵罐转速400 r/min，设置溶氧不低于25%，催化反应温度35°C，催化反应时间40 h，待反应结束后，利用液相色谱法（HPLC）对催化反应液组分进行定量分析。

本实施例中所建立的α-KG生产方法，不需要外源添加昂贵的过氧化氢酶，整个催化反应过程无需控制反应体系pH值，可大大节约生产成本和简化工艺流程。

本实施例中所述HPLC分析，具体方法为：取全细胞催化反应液1 mL，12000×g离心5 min后取上清，使用0.02 μm孔径滤膜进行过滤。反应液组分采用高效液相色谱（Agilent1200，USA）测定，色谱条件为：分析柱采用Bio-Rad Aminex HPX-87H色谱柱，流动相为5 mMH₂SO₄，流速为0.6>

经液相色谱检测分析，基于pXMJ19-tac-lgox-katE构建获得的共表达菌株表现出最高α-KG生产能力，其全细胞催化反应液中α-KG的含量可达200.0 g/L，底物摩尔转化率达95%以上，且反应液中无复杂组分，有助于简化下游分离纯化流程，具有较好的技术应用前景。

实施例5 谷氨酸氧化酶突变体构建及活性分析

本实施例用于提供一种酶活提高的谷氨酸氧化酶突变体构建方法。通过分析谷氨酸氧化酶的3D结构与同源序列比对，确定SEQ ID NO:1的氨基酸序列的第280位丝氨酸S和第533位组氨酸H为目的突变位点。利用定点突变技术，根据待突变的氨基酸位点来设计点突变引物，通过PCR方法获得谷氨酸氧化酶突变序列。

选用pXMJ19-tac-lgox-katE质粒为模板，利用S280T-5F和LGOX-DN引物对扩增获得lgox-S280T上游片段，利用LGOX-UP和S280T-3R引物对扩增获得lgox-S280T下游片段。将此上下游片段混合后作为模板，基于融合PCR原理，利用LGOX-UP/LGOX-DN引物对扩增获得lgox-S280T片段，即为含有S280T单突变位点的谷氨酸氧化酶。将该谷氨酸氧化酶突变序列和pET21b载体进行连接，构建获得pET21b-lgox-S280T重组质粒。选用lgox-S280T片段为模板，分别利用LGOX-UP/H533L-3R引物对和H533L-5F/LGOX-DN和引物对，扩增获得lgox-S280T H533L的上下游片段。将此上下游片段混合后作为模板，基于融合PCR原理，利用LGOX-UP/LGOX-DN引物对扩增获得lgox-S280T H533L片段，即为含有S280TH533L双突变位点的谷氨酸氧化酶。将该谷氨酸氧化酶突变序列和pET21b载体进行连接，构建获得pET21b-lgox-S280TH533L重组质粒。将上述重组质粒分别转化E.>BL21(DE3)感受态细胞，经过平板抗性筛选后，挑取转化子并测序验证。将构建成功的E.>BL21/pET21b-lgox-S280T、E.>BL21/pET21b-lgox-S280TH533L重组工程菌与含有未突变谷氨酸氧化酶基因的重组工程菌，分别接种于5 mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，37°C、200 r/min 过夜培养后，按照1%接种量重新转接于100 mL含有氨苄青霉素的LB培养基中，待菌体密度达OD₆₀₀值为0.6时，加入终浓度为0.4>600值为10左右，利用超声波细胞破碎仪进行细胞破碎，设置超声波功率200>

本实施例中所述Ni-NTA纯化采用标准实验室方案。具体方法为：纯化所用填料为镍，整个纯化过程在4°C冰箱中进行。将1-2 mL填料注入层析柱后，用3~5 倍柱体积的去离子水冲洗柱子，再加入5倍柱体积的裂解缓冲液（20 mM Na₂HPO₄，200>2HPO₄，200>2HPO₄，200>2HPO₄，pH>

利用Ni-NTA纯化后获得的纯酶进行酶促反应来测定酶活力。酶促反应的总体积为1 mL，包括600 μL 100 mM谷氨酸钠底物，300 μL ddH₂O和100>

实施例6 谷氨酸氧化酶突变体在生物转化生产α-KG中的应用

本实施例用于提供一种谷氨酸氧化酶突变体在α-KG生产中的应用。利用定点突变技术，以上述实施例1中构建的pXMJ19-tac-lgox-katE质粒为模板，分别以S280T-5F/S280T-3R和H533L-5F/H533L-3R为引物，获得同时含有S280T和H533L突变位点的重组表达质粒，命名为pXMJ19-tac-lgoxS280TH533L-katE。将该突变质粒转化谷氨酸棒杆菌，经过平板抗性筛选后，获得pXMJ19-tac-lgoxS280TH533L-katE共表达菌株，根据实施例4中建立的全细胞转化工艺，进行α-KG生产。具体方法为：利用发酵罐建立5 L全细胞催化体系，添加270 g/L终浓度的谷氨酸钠一水合物（味精）底物，加入10 g/L全细胞菌泥，控制发酵罐转速400 r/min，设置溶氧不低于25%，催化反应温度35°C，催化反应时间32 h。待反应结束后，利用液相色谱法（HPLC）对催化反应液组分进行定量分析。

如图4所示，经液相色谱检测分析，全细胞转化液中成分较为单一，底物及杂质残留较少。基于谷氨酸氧化酶突变体构建获得的共表达菌株表现出更优的α-KG生产能力，在全细胞转化反应32 h后，转化液中α-KG的含量可达205.0 g/L，底物摩尔转化率可达97.5%，与含有未突变谷氨酸氧化酶基因的重组工程菌相比，在全细胞催化时间、产物产量及摩尔转化率等方面都具有更好优势，可大大节约生产成本和简化工艺流程，具有良好的工业化应用前景。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 谷氨酸氧化酶突变体、双酶共表达载体及其应用

<130> CPCN19111019

<141> 2019-08-22

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 622

<212> PRT

<213> Streptomyces mobaraensis

<400> 1

Met Ala Val Pro Ala Lys Ser Thr Ala Asp Trp Asp Thr Cys Leu Glu

1 5 1015

Val Ala Arg Ala Leu Leu Val Val Asp Glu His Asp Arg Pro Leu Val

202530

Pro Glu Tyr Lys Lys Ile Leu Asp Asp Gly Leu Pro Arg Thr Gly Lys

354045

Lys Ala Gly Arg Lys Val Leu Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu

505560

Val Ala Ala Trp Leu Leu Lys Arg Ala Gly His His Val Thr Leu Leu

65707580

Glu Ala Asn Gly Asn Arg Val Gly Gly Arg Ile Lys Thr Phe Arg Lys

859095

Gly Gly His Glu His Ala Val Gln Pro Phe Ala Asp Pro Arg Gln Tyr

100 105 110

Ala Glu Ala Gly Ala Met Arg Ile Pro Gly Ser His Pro Leu Val Met

115 120 125

Ser Leu Ile Asp Gly Leu Gly Val Lys Arg Arg Pro Phe Tyr Leu Val

130 135 140

Asp Val Asp Gly Gln Gly Lys Pro Val Asn His Ala Trp Leu His Val

145 150 155 160

Asn Gly Val Arg Val Arg Arg Ala Asp Tyr Val Lys Asp Pro Arg Lys

165 170 175

Val Asn Arg Ser Phe Gly Val Pro Arg Glu Leu Trp Asp Thr Pro Ser

180 185 190

Ser Val Ile Leu Arg Arg Val Leu Asp Pro Val Arg Asp Glu Phe Ser

195 200 205

Thr Ala Gly Ala Asp Gly Lys Arg Val Asp Lys Pro Met Pro Glu Arg

210 215 220

Val Lys Gly Trp Ala Arg Val Ile Gln Lys Tyr Gly Asp Trp Ser Met

225 230 235 240

Tyr Arg Phe Leu Thr Glu Glu Ala Gly Phe Asp Glu Arg Thr Leu Asp

245 250 255

Leu Val Gly Thr Leu Glu Asn Leu Thr Ser Arg Leu Pro Leu Ser Phe

260 265 270

Val His Ser Phe Ile Ser Gln Ser Leu Ile Ser Pro Asp Thr Ala Phe

275 280 285

Trp Glu Leu Val Gly Gly Thr Ala Ser Leu Pro Asp Ala Leu Leu Lys

290 295 300

Lys Val Asp Asp Val Leu Arg Leu Asp Arg Arg Ala Thr Arg Ile Glu

305 310 315 320

Tyr Trp Ser Pro Asp Arg Thr Gly Ala Asp Arg Ala Thr His Val Arg

325 330 335

Glu Gly Gly Pro His Val Trp Ile Asp Thr Val Ser Glu Gly Arg Asp

340 345 350

Gly Lys Val Val Arg Glu Gln Phe Thr Gly Asp Leu Ala Ile Val Thr

355 360 365

Val Pro Phe Thr Gly Leu Arg His Val Gln Val Ser Pro Leu Met Ser

370 375 380

Tyr Gly Lys Arg Arg Ala Val Thr Glu Leu His Tyr Asp Ser Ala Thr

385 390 395 400

Lys Val Leu Leu Glu Phe Ser Arg Arg Trp Trp Glu Phe Thr Glu Glu

405 410 415

Asp Trp Lys Arg Glu Leu Glu Asp Val Arg Pro Gly Leu Tyr Ala Ala

420 425 430

Tyr Arg Asp Gly Lys Ala Pro Ala Asp Gly Ser Leu Leu Gly Thr His

435 440 445

Pro Ser Val Pro His Gly His Ile Ser Gln Ala Gln Arg Ala His Tyr

450 455 460

Ala Ala Asn Tyr Trp Glu Gly Arg Asp Gln Pro Glu Ala Ala His Ile

465 470 475 480

Val Gly Gly Gly Ser Val Ser Asp Asn Pro Asn Arg Phe Met Phe Asn

485 490 495

Pro Ser His Pro Val Pro Gly Ser Glu Gly Gly Val Val Leu Ala Val

500 505 510

Tyr Cys Trp Ala Asp Asp Ala Ser Arg Trp Asp Ser Leu Asp Asp Glu

515 520 525

Ala Arg Tyr Pro His Ala Leu Cys Gly Leu Gln Gln Val Tyr Gly Gln

530 535 540

Arg Val Glu Val Phe Tyr Thr Gly Ala Gly Arg Thr Gln Ser Trp Leu

545 550 555 560

Arg Asp Pro Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Ser Val Leu Leu Pro Gly Gln

565 570 575

His Thr Glu Leu Leu Gly Ala Ile Arg Glu Pro Glu Gly Pro Leu His

580 585 590

Phe Ala Gly Asp His Thr Ser Val Lys Pro Ser Trp Ile Glu Gly Ala

595 600 605

Val Glu Ser Gly Val Arg Ala Ala Leu Glu Ala His Leu Ala

610 615 620

<210> 2

<211> 1869

<212> DNA

<213> Streptomyces mobaraensis

<400> 2

atggcggttc ctgcgaaaag caccgcggat tgggatacct gtctggaagt ggcgcgcgcg 60

ttattagtgg tggatgaaca tgatcgtccg ctggtgccgg aatataagaa gattctggat 120

gatggcctgc ctcgcaccgg taaaaaagcg ggccgcaaag tgttagttgt tggtgcgggt 180

cctgcaggtt tagttgcggc gtggctgtta aaacgtgcgg gtcatcatgt gactctgctg 240

gaagcgaacg gcaatcgtgt tggcggccgc attaaaacct ttcgcaaagg cggccatgaa 300

catgcggttc agccgtttgc agatccgcgt cagtatgcag aagcaggcgc gatgcgtatt 360

cctggcagcc atccgttagt gatgagcctg attgatggcc tgggtgttaa acgccgcccg 420

ttttatctgg tggatgtgga tggccaaggc aaaccggtta accatgcgtg gctgcatgtg 480

aatggtgttc gcgttcgccg tgcggattat gtgaaagatc cgcgcaaagt gaaccgcagc 540

tttggtgtgc cgcgtgaatt atgggatacc ccgagcagcg ttattctgcg ccgcgtttta 600

gatcctgtgc gcgatgaatt ttcaaccgcg ggcgcggatg gtaaacgcgt ggataaaccg 660

atgccggaac gcgttaaagg ttgggcgcgc gtgattcaga aatatggcga ctggagcatg 720

tatcgctttc tgaccgaaga agcgggcttt gatgaacgca ccctggattt agttggcacc 780

ctggaaaact taaccagccg cctgccgtta agctttgtgc atagctttat tagccagagc 840

ctgatttcac cggataccgc gttttgggaa ctggttggtg gcaccgcgag cttacctgat 900

gcgctgctga aaaaagtgga tgatgtgctg cgcttagatc gtcgtgcgac ccgcattgaa 960

tattggagcc cggatcgtac tggtgcggat cgtgcgaccc atgttcgtga aggtggtccg 1020

catgtgtgga ttgataccgt gagcgaaggc cgcgatggca aagttgtgcg cgaacagttt 1080

actggcgatc tggcgattgt gaccgtgccg tttaccggtc tgcgccatgt tcaagtgagc 1140

ccgctgatga gctatggtaa acgtcgcgcg gtgaccgaac tgcattatga tagcgcgacc 1200

aaagtgctgc tggaatttag ccgccgctgg tgggaattta ccgaagaaga ttggaaacgc 1260

gaactggaag atgttcgccc gggcttatat gcagcgtatc gcgatggtaa agcgcctgcg 1320

gatggtagct tattaggcac ccatccgtca gttccgcatg gccatattag ccaagcgcag 1380

cgtgcacatt atgcggcgaa ctattgggaa ggccgcgatc aacctgaagc ggcgcatatt 1440

gttggtggtg gcagcgttag cgataacccg aaccgcttta tgtttaaccc gagccatccg 1500

gttcctggta gcgaaggtgg tgttgtgctg gcggtttatt gctgggcgga tgatgcaagc 1560

cgttgggata gcctggatga tgaagcgcgc tatccgcatg cactgtgtgg tctgcaacag 1620

gtttatggcc agcgcgtgga agtgttttat accggcgcgg gtcgtactca atcatggctg 1680

cgtgatccgt atgcgtatgg cgaagcgagc gttttattac ctggccagca taccgaatta 1740

ctgggcgcga ttcgcgaacc tgaaggccct ttacattttg cgggcgatca tacctcagtg 1800

aaaccgagct ggattgaagg tgcggtggaa agcggtgttc gtgcggcgtt agaagcgcat 1860

ttagcgtaa 1869

<210> 3

<211> 753

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 3

Met Ser Gln His Asn Glu Lys Asn Pro His Gln His Gln Ser Pro Leu

1 5 1015

His Asp Ser Ser Glu Ala Lys Pro Gly Met Asp Ser Leu Ala Pro Glu

202530

Asp Gly Ser His Arg Pro Ala Ala Glu Pro Thr Pro Pro Gly Ala Gln

354045

Pro Thr Ala Pro Gly Ser Leu Lys Ala Pro Asp Thr Arg Asn Glu Lys

505560

Leu Asn Ser Leu Glu Asp Val Arg Lys Gly Ser Glu Asn Tyr Ala Leu

65707580

Thr Thr Asn Gln Gly Val Arg Ile Ala Asp Asp Gln Asn Ser Leu Arg

859095

Ala Gly Ser Arg Gly Pro Thr Leu Leu Glu Asp Phe Ile Leu Arg Glu

100 105 110

Lys Ile Thr His Phe Asp His Glu Arg Ile Pro Glu Arg Ile Val His

115 120 125

Ala Arg Gly Ser Ala Ala His Gly Tyr Phe Gln Pro Tyr Lys Ser Leu

130 135 140

Ser Asp Ile Thr Lys Ala Asp Phe Leu Ser Asp Pro Asn Lys Ile Thr

145 150 155 160

Pro Val Phe Val Arg Phe Ser Thr Val Gln Gly Gly Ala Gly Ser Ala

165 170 175

Asp Thr Val Arg Asp Ile Arg Gly Phe Ala Thr Lys Phe Tyr Thr Glu

180 185 190

Glu Gly Ile Phe Asp Leu Val Gly Asn Asn Thr Pro Ile Phe Phe Ile

195 200 205

Gln Asp Ala His Lys Phe Pro Asp Phe Val His Ala Val Lys Pro Glu

210 215 220

Pro His Trp Ala Ile Pro Gln Gly Gln Ser Ala His Asp Thr Phe Trp

225 230 235 240

Asp Tyr Val Ser Leu Gln Pro Glu Thr Leu His Asn Val Met Trp Ala

245 250 255

Met Ser Asp Arg Gly Ile Pro Arg Ser Tyr Arg Thr Met Glu Gly Phe

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Gly Ile His Thr Phe Arg Leu Ile Asn Ala Glu Gly Lys Ala Thr Phe

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Val Arg Phe His Trp Lys Pro Leu Ala Gly Lys Ala Ser Leu Val Trp

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Glu Leu Trp Glu Ala Ile Glu Ala Gly Asp Phe Pro Glu Tyr Glu Leu

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Gly Phe Gln Leu Ile Pro Glu Glu Asp Glu Phe Lys Phe Asp Phe Asp

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Leu Leu Asp Pro Thr Lys Leu Ile Pro Glu Glu Leu Val Pro Val Gln

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Arg Val Gly Lys Met Val Leu Asn Arg Asn Pro Asp Asn Phe Phe Ala

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Glu Asn Glu Gln Ala Ala Phe His Pro Gly His Ile Val Pro Gly Leu

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Asp Phe Thr Asn Asp Pro Leu Leu Gln Gly Arg Leu Phe Ser Tyr Thr

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Asp Thr Gln Ile Ser Arg Leu Gly Gly Pro Asn Phe His Glu Ile Pro

420 425 430

Ile Asn Arg Pro Thr Cys Pro Tyr His Asn Phe Gln Arg Asp Gly Met

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His Arg Met Gly Ile Asp Thr Asn Pro Ala Asn Tyr Glu Pro Asn Ser

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Ile Asn Asp Asn Trp Pro Arg Glu Thr Pro Pro Gly Pro Lys Arg Gly

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Gly Phe Glu Ser Tyr Gln Glu Arg Val Glu Gly Asn Lys Val Arg Glu

485 490 495

Arg Ser Pro Ser Phe Gly Glu Tyr Tyr Ser His Pro Arg Leu Phe Trp

500 505 510

Leu Ser Gln Thr Pro Phe Glu Gln Arg His Ile Val Asp Gly Phe Ser

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Phe Glu Leu Ser Lys Val Val Arg Pro Tyr Ile Arg Glu Arg Val Val

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Asp Gln Leu Ala His Ile Asp Leu Thr Leu Ala Gln Ala Val Ala Lys

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Asn Leu Gly Ile Glu Leu Thr Asp Asp Gln Leu Asn Ile Thr Pro Pro

565 570 575

Pro Asp Val Asn Gly Leu Lys Lys Asp Pro Ser Leu Ser Leu Tyr Ala

580 585 590

Ile Pro Asp Gly Asp Val Lys Gly Arg Val Val Ala Ile Leu Leu Asn

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Asp Glu Val Arg Ser Ala Asp Leu Leu Ala Ile Leu Lys Ala Leu Lys

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Ala Lys Gly Val His Ala Lys Leu Leu Tyr Ser Arg Met Gly Glu Val

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Tyr Lys His Leu Lys Pro Ile Ala Leu Ala Gly Asp Ala Arg Lys Phe

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Lys Ala Thr Ile Lys Ile Ala Asp Gln Gly Glu Glu Gly Ile Val Glu

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Ala Asp Ser Ala Asp Gly Ser Phe Met Asp Glu Leu Leu Thr Leu Met

725 730 735

Ala Ala His Arg Val Trp Ser Arg Ile Pro Lys Ile Asp Lys Ile Pro

740 745 750

Ala

<210> 4

<211> 2262

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 4

atgtcgcaac ataacgaaaa gaacccacat cagcaccagt caccactaca cgattccagc 60

gaagcgaaac cggggatgga ctcactggca cctgaggacg gctctcatcg tccagcggct 120

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cgtaacgaaa aacttaattc tctggaagac gtacgcaaag gcagtgaaaa ttatgcgctg 240

accactaatc agggcgtgcg catcgccgac gatcaaaact cactgcgtgc cggtagccgt 300

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ggcatccccc gcagttaccg caccatggaa ggcttcggta ttcacacctt ccgcctgatt 840

aatgccgaag ggaaggcaac gtttgtacgt ttccactgga aaccactggc aggtaaagcc 900

tcactcgttt gggatgaagc acaaaaactc accggacgtg acccggactt ccaccgccgc 960

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acggtcgatg cggtcattgt cccttgcggc aatatcgcgg atatcgctga caacggcgat 2040

gccaactact acctgatgga agcctacaaa caccttaaac cgattgcgct ggcgggtgac 2100

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<210> 5

<211> 622

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

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1 5 1015

Val Ala Arg Ala Leu Leu Val Val Asp Glu His Asp Arg Pro Leu Val

202530

Pro Glu Tyr Lys Lys Ile Leu Asp Asp Gly Leu Pro Arg Thr Gly Lys

354045

Lys Ala Gly Arg Lys Val Leu Val Val Gly Ala Gly Pro Ala Gly Leu

505560

Val Ala Ala Trp Leu Leu Lys Arg Ala Gly His His Val Thr Leu Leu

65707580

Glu Ala Asn Gly Asn Arg Val Gly Gly Arg Ile Lys Thr Phe Arg Lys

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Gly Gly His Glu His Ala Val Gln Pro Phe Ala Asp Pro Arg Gln Tyr

100 105 110

Ala Glu Ala Gly Ala Met Arg Ile Pro Gly Ser His Pro Leu Val Met

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Ser Leu Ile Asp Gly Leu Gly Val Lys Arg Arg Pro Phe Tyr Leu Val

130 135 140

Asp Val Asp Gly Gln Gly Lys Pro Val Asn His Ala Trp Leu His Val

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Asn Gly Val Arg Val Arg Arg Ala Asp Tyr Val Lys Asp Pro Arg Lys

165 170 175

Val Asn Arg Ser Phe Gly Val Pro Arg Glu Leu Trp Asp Thr Pro Ser

180 185 190

Ser Val Ile Leu Arg Arg Val Leu Asp Pro Val Arg Asp Glu Phe Ser

195 200 205

Thr Ala Gly Ala Asp Gly Lys Arg Val Asp Lys Pro Met Pro Glu Arg

210 215 220

Val Lys Gly Trp Ala Arg Val Ile Gln Lys Tyr Gly Asp Trp Ser Met

225 230 235 240

Tyr Arg Phe Leu Thr Glu Glu Ala Gly Phe Asp Glu Arg Thr Leu Asp

245 250 255

Leu Val Gly Thr Leu Glu Asn Leu Thr Ser Arg Leu Pro Leu Ser Phe

260 265 270

Val His Ser Phe Ile Ser Gln Thr Leu Ile Ser Pro Asp Thr Ala Phe

275 280 285

Trp Glu Leu Val Gly Gly Thr Ala Ser Leu Pro Asp Ala Leu Leu Lys

290 295 300

Lys Val Asp Asp Val Leu Arg Leu Asp Arg Arg Ala Thr Arg Ile Glu

305 310 315 320

Tyr Trp Ser Pro Asp Arg Thr Gly Ala Asp Arg Ala Thr His Val Arg

325 330 335

Glu Gly Gly Pro His Val Trp Ile Asp Thr Val Ser Glu Gly Arg Asp

340 345 350

Gly Lys Val Val Arg Glu Gln Phe Thr Gly Asp Leu Ala Ile Val Thr

355 360 365

Val Pro Phe Thr Gly Leu Arg His Val Gln Val Ser Pro Leu Met Ser

370 375 380

Tyr Gly Lys Arg Arg Ala Val Thr Glu Leu His Tyr Asp Ser Ala Thr

385 390 395 400

Lys Val Leu Leu Glu Phe Ser Arg Arg Trp Trp Glu Phe Thr Glu Glu

405 410 415

Asp Trp Lys Arg Glu Leu Glu Asp Val Arg Pro Gly Leu Tyr Ala Ala

420 425 430

Tyr Arg Asp Gly Lys Ala Pro Ala Asp Gly Ser Leu Leu Gly Thr His

435 440 445

Pro Ser Val Pro His Gly His Ile Ser Gln Ala Gln Arg Ala His Tyr

450 455 460

Ala Ala Asn Tyr Trp Glu Gly Arg Asp Gln Pro Glu Ala Ala His Ile

465 470 475 480

Val Gly Gly Gly Ser Val Ser Asp Asn Pro Asn Arg Phe Met Phe Asn

485 490 495

Pro Ser His Pro Val Pro Gly Ser Glu Gly Gly Val Val Leu Ala Val

500 505 510

Tyr Cys Trp Ala Asp Asp Ala Ser Arg Trp Asp Ser Leu Asp Asp Glu

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530 535 540

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565 570 575

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595 600 605

Val Glu Ser Gly Val Arg Ala Ala Leu Glu Ala His Leu Ala

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<210> 6

<211> 1869

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6