比率型硫化氢荧光探针及其制备方法和其在水质硫化物检测中的应用以及硫化氢检测方法

摘要

本发明公开了一种比率型硫化氢荧光探针及其制备方法和其在水质硫化物检测中的应用以及硫化氢检测方法。该比率型硫化氢荧光探针其结构式如式I所示：

说明书

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，特别涉及一种比率型硫化氢荧光探针及其制备方法和其在水质硫化物检测中的应用以及硫化氢检测方法。

背景技术

水中硫化物包括溶解性的H₂S、HS^-、S^2-、有机类硫化物等，其存在对农作物生长、水生生物的生存造成严重威胁，被称为“水产养殖第一杀手”。更重要的是水质中硫化物不稳定，容易受周围环境的影响，尤其是酸性条件下释放出来的有毒气体H₂S，达到一定浓度，对人体伤害极大。因此，进行水质硫化物高效、实时检测具有重要意义。

目前水质硫化物检测方法主要包括亚甲基蓝分光光度法、碘量法、离子电极法、重金属沉淀比色法等，其中亚甲基蓝分光光度法(GB/T 16489-1996水质硫化物的测定)，于1996-08-01发布，1997-01-01实施，是目前应用最多的检测方法。同时海洋行业、城镇建设行业、水产养殖业等针对不同浓度的水质硫化物检测都有各自的行业标准。但是这些众多的检测技术或者检测方法存在着外界抗干扰能力差、检测灵敏度不高等问题，测量数据的置信度和可比性缺乏统一的标准。随着最新的水质硫化物安全浓度数据的出台，尤其是在水产养殖、饮用水等领域，目前的水质硫化物检测方法已经无法满足需求。因此亟需发展新一代具有行业普适性的水质硫化氢高效检测技术。荧光检测技术具有操作简单，可实现原位检测以及可视化等优点，已经发展成为生物体内微量硫化氢检测的重要手段。本发明即是在此背景下，我们设计合成了一种新的比率型硫化氢荧光探针。

发明内容

有鉴于此，本发明提出一种比率型硫化氢荧光探针；

本发明还提出一种比率型硫化氢荧光探针的制备方法；

本发明还提出一种比率型硫化氢荧光探针在水质硫化物检测中的应用；

本发明还提出一种基于比率型硫化氢荧光探针的硫化氢检测方法。

本发明的技术方案是：

本发明提供一种式IV所示的一种新型比率型硫化氢荧光探针：

式IV中R1为C2-C5脂肪烷基，或硝基，或甲氧基，或卤素，或羧基，或乙酰基。

更进一步，所述比率型硫化氢荧光探针为下列之一：

本发明还提供了一种比率型硫化氢荧光探针的制备方法。如图1所示，所述制备方法为：将化合物I，苯乙炔，双三苯基磷二氯化钯，碘化亚铜，三乙胺按照一定的比例加入到四氢呋喃溶液中，50℃搅拌反应6h，反应液纯化得到化合物II，所述化合物I，苯乙炔，双三苯基磷二氯化钯，碘化亚铜，三乙胺按照摩尔比的比例为0.5～1:2:2:3：3，优选为1:2:2:2:3；将化合物II，氢氧化钾按照一定比例加入到甲醇溶液中，65℃反应8h，反应液经过纯化得到化合物III，所述化合物II，氢氧化钾按照摩尔比的比例为0.5～1.5:4，优选为1:3；将化合物III，叠氮三甲基硅烷，亚硝酸叔丁酯按照一定的比例加入到乙腈溶液中，一定温度下反应20h，将反应液纯化得到目标化合物VI，所述化合物III，叠氮三甲基硅烷，亚硝酸叔丁酯按照摩尔比的比例为0.5～1.5:2:3，优选为1:2:3，所述温度为0℃～100℃，优选35℃～45℃。

本发明还提供了一种硫化氢检测方法：将比率型硫化氢荧光探针配置成10mM的母液，然后取所述母液1μL加入到一定体积的溶剂里，稀释成为0μM-50μM的不同浓度的荧光探针检测液；将待检硫化氢样品水溶液加入到所述荧光探针检测液中，根据不同浓度的硫化氢与荧光探针反应产生的荧光强度的不同从而被荧光检测器捕捉，从而得到样品浓度。

更具体地，检测反应液中所述硫化氢浓度为0μM～100μM。待测样品在pH为7.5的PBS缓冲溶液中配置10mM样品溶液。检测反应液中标准样品的浓度为0μM～50μM。将硫化氢水溶液加入到荧光探针溶液中，反应5分钟，反应液使用荧光光谱仪测定荧光强度。

本发明还提供了一种比率型硫化氢荧光探针应用于水质硫化物检测：取待测水样1ml，加入到比色管中，加入荧光试剂0.1～0.5mL(浓度为10μM)和酸化试剂0.1～0.5mL(盐酸试剂，浓度为10％)，震荡静置5分钟，使用荧光检测仪获得荧光强度数据(激发波长375nm)，参照硫化氢浓度与荧光强度对照数值之间的关系数据，即得到水质硫化物的浓度。

相对于现有技术，本发明提供的比率型硫化氢荧光探针具有以下优点：

该比率型硫化氢荧光探针具有合成方法简单、荧光量子产率高，比率计量型特点明显等优点。该荧光探针被成功应用于水质硫化物检测，具有良好的水质硫化物检测性能，特别是在工业废水中硫化物的检测和生活污水中硫化物的检测方面，均取得了较好的检测效果。

附图说明

图1为本发明荧光探针的反应路线图。

图2为本发明的荧光探针在pH为7.5条件下，加入0μM和50μM硫化氢浓度的紫外吸收光谱测定图。

图3为本发明在pH为7.5条件下，荧光探针5μM与不同化合物50μM反应5min的选择性实验，激发波长为375nm，发射波长为512nm，荧光探针的选择性检测图。

图4为本发明的荧光探针在pH为7.5条件下，不同硫化物当量中激发波长为375nm,发射波长为512nm处的荧光效果检测图。

图5为本发明的荧光探针在pH为7.5条件下，激发波长为375nm条件下不同时间的荧光强度示意图。

图6为本发明的荧光探针式VI-1对水质硫化物的检测效果图。

具体实施方式

为更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表述的范围。

实施例1：制备N-(5-苯乙炔喹啉-8-氨基)苯酰胺

将式I所示的N-(5-碘喹啉-8-氨基)苯酰胺0.1mmol，苯乙炔0.3mmol，双三苯基磷二氯化钯0.05mmol，CuI 0.01mmol，三乙胺0.5ml加入到10ml四氢呋喃溶液中，氮气保护，搅拌升温至30℃反应12h，反应结束后，向反应液中加入饱和NaCl水溶液，使用乙酸乙酯萃取，有机相经过无水硫酸镁干燥，过滤，溶剂经过旋蒸出去，粗品经过柱层析分离，乙酸乙酯：石油醚为1:30为流动相，得到式II-1所示化合物30mg。

¹H>3)δ10.83(s,1H),8.93(d,J＝8.1Hz,1H),8.89(dd,J＝4.2,1.6Hz,1H),8.73(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),8.09(dd,J＝8.0,1.4Hz,2H),7.86(d,J＝8.1Hz,1H),7.65–7.61(m,2H),7.60–7.50(m,4H),7.40–7.26(m,3H).¹³C>3)δ165.47,148.68,138.43,135.18,135.09,134.89,132.06,131.88,131.62,128.88,128.52,128.27,127.35,123.12,122.32,116.04,114.94,94.16,86.38。

实施例2：制备N-(5-苯乙炔喹啉-8-氨基)苯酰胺

将式I所示的N-(5-碘喹啉-8-氨基)苯酰胺0.1mmol，苯乙炔0.2mmol，双三苯基磷二氯化钯0.1mmol，CuI 0.02mmol，三乙胺0.5ml加入到10ml四氢呋喃溶液中，氮气保护，搅拌升温至50℃反应12h，反应结束后，向反应液中加入饱和NaCl水溶液，使用乙酸乙酯萃取，有机相经过无水硫酸镁干燥，过滤，溶剂经过旋蒸出去，粗品经过柱层析分离，乙酸乙酯：石油醚为1:30为流动相，得到式II-1所示化合物32mg。

实施例3：制备5-苯乙炔-8-氨基喹啉

将式II-1所示的N-(5-苯乙炔喹啉-8-氨基)苯酰胺0.1mmol，KOH0.3mmol加入到25ml甲醇溶液中，搅拌加热回流2h，反应结束后，向反应液中加入饱和NaCl水溶液，使用乙酸乙酯萃取，有机相经过无水硫酸镁干燥，过滤，溶剂经过旋蒸出去，粗品经过柱层析分离，乙酸乙酯：石油醚为1:10为流动相，得到式III-1所示化合物19mg。

¹H>3)δ8.78(dd,J＝4.1,1.7Hz,1H),8.63(dd,J＝8.4,1.7Hz,1H),7.66–7.55(m,3H),7.48(dd,J＝8.4,4.2Hz,1H),7.40–7.31(m,3H),6.85(d,J＝7.9Hz,1H),5.23(s,2H).¹³C>3)δ147.74,144.92,137.79,134.76,132.22,131.38,129.21,128.44,127.93,123.80,122.12,109.31,108.34,92.18,87.47。

实施例4：制备5-苯乙炔-8-氨基喹啉

将式II-1所示的N-(5-苯乙炔喹啉-8-氨基)苯酰胺0.1mmol，KOH0.3mmol，加入到25ml甲醇溶液中，搅拌加热至50℃，反应5h，反应结束后，向反应液中加入饱和NaCl水溶液，使用乙酸乙酯萃取，有机相经过无水硫酸镁干燥，过滤，溶剂经过旋蒸出去，粗品经过柱层析分离，乙酸乙酯：石油醚为1:10为流动相，得到式III-1所示化合物22mg。

实施例5：制备5-苯乙炔-8-叠氮喹啉

将式III-1所示的5-苯乙炔-8-氨基喹啉0.1mmol加入到10ml乙腈溶液中溶解，分别加入叠氮三甲基硅烷0.3mmol，亚硝酸叔丁酯0.3mmol，搅拌加热到50℃，反应20h，反应结束后，反应液直接旋干，柱层析分离纯化，乙酸乙酯：石油醚等于1:20，得到式VI-1化合物16mg。

¹H>3)δ8.99(dd,J＝4.1,1.6Hz,1H),8.75(dd,J＝8.5,1.7Hz,1H),7.78(d,J＝7.9Hz,1H),7.65(dd,J＝6.5,3.2Hz,2H),7.60(dd,J＝8.5,4.2Hz,1H),7.48–7.40(m,3H),7.38(d,J＝7.9Hz,1H).¹³C>3)δ149.76,141.21,137.68,135.03,131.64,130.71,129.56,128.77,128.55,122.81,122.58,117.84,117.47,85.89。

实施例6：荧光探针式VI-1，在pH为7.5条件下加入浓度为0μM和50μM硫化氢的紫外吸收光谱测定

准确称取实施例5中制备的探针VI-1，用二甲基亚砜配置成浓度为10mM的荧光探针母液，使用移液器吸取1μL加入到磷酸缓冲液和DMSO的混合溶液中(体积为1mL,体积比为5:5)，此时荧光探针浓度为10μM。其中一个里面加入1μL，浓度为50mM的硫化物水溶液，使反应体系中硫化氢浓度为50μM。为另一个设置空白对照，37℃下反应5分钟，测定两个混合液的紫外吸收光谱，结果见图2。所述探针与硫化氢反应前在325nm出现强的吸收峰，与硫化氢反应后，在375nm出现强的吸收峰，表现出明显的比率型探针特点。

实施例7：荧光探针式VI-1，在pH为7.5条件下的选择性实验

准确称取实施例5中制备的探针VI-1，用二甲基亚砜配置成浓度为10mM的荧光探针母液，使用移液器吸取1μL加入到磷酸缓冲液和DMSO的混合溶液中(体积为1mL,体积比为5:5)，分别加入1μL硫化氢水溶液和其他对照结构(磷酸二氢钠，磷酸钠，硝酸钠，碳酸钠，氯化钠，叠氮化钠，乙酸钠，碳酸氢钠，谷胱甘肽，半胱氨酸，同型半胱氨酸)，使得反应体系中对照组物质浓度与硫化氢的浓度为100μM，探针浓度为10μM。反应液在37℃条件下反应5分钟，测定其荧光值。激发波长为375nm，发射波长为512nm。荧光强度比值见图3。所述结果表明，该荧光探针对硫化氢检测有很好的专一选择性。

实施例8：荧光探针式VI-1，在pH为7.5，激发波长为375nm的条件下加入不同浓度的硫化氢的荧光检测效果

准确称取实施例5中制备的探针VI-1，用二甲基亚砜配置成浓度为10mM的荧光探针母液，使用移液器吸取1μL加入到磷酸缓冲液和DMSO的混合溶液(体积为1mL，体积比为5:5)，此时溶液中探针浓度为10μM，分别加入1μL不同浓度硫化氢水溶液(最终硫化氢在反应体系中的浓度分别为0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM)，37℃条件下反应5min，测定其荧光强度值。激发波长为375nm，发射波长为512nm，荧光强度见图4，所述结果表明，该荧光探针检测硫化氢浓度与荧光强度呈现良好线性关系。

实施例9：荧光探针式VI-1，在pH为7.5，激发波长为365nm条件下不同时间的荧光强度

准确称取实施例5中制备的探针VI-1，用二甲基亚砜配置成浓度为10mM的荧光探针母液，使用移液器吸取1μL加入到磷酸缓冲液和DMSO的混合溶液中(体积为1mL,体积比为5:5)，分别加入1μL不同浓度硫化氢水溶液(反应体系中硫化氢浓度为100μM)，分别测定不同时间段(0-30min)的荧光强度，激发波长为375nm，发射波长为512nm，荧光强度见图5。所述结果表明，该荧光探针检测硫化氢浓度速度较快。

实施例10：荧光探针式VI-1对水质硫化物检测效果

准确称取实施例5中制备的探针VI-1，用二甲基亚砜配置成浓度为10mM的荧光探针母液，使用移液器吸取1μL加入到磷酸缓冲液和DMSO的混合溶液中(体积为1mL，体积比为5:5)。同时取待测水质硫化物样品3mL置于比色管中，使用滴管将0.2ml荧光探针，0.1ml酸化试剂加入到待测水样中，于37℃反应5min，测定荧光强度。激发波长为375nm，荧光颜色由蓝色变化为橘黄色，见图6。所述结果表明，该荧光探针检测可以通过比率型特点实现水质硫化物有效检测。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。