Optimization of lentiviral vector technology for gene transfer into adult neural stem cells.

摘要

Samenvatting: Optimalisatie van lentivirale vector technologie voor gent ransfer in adulte neurale stamcellen. Er zijn vandaag bewijzen voorhanden dat multipotente neurale stamc ellen een rol spelen in het centraal zenuwstelsel van zoogdieren inclusi ef van mensen. Gedurende het normale verouderingsproces blijven ad ulte neurale stamcellen aanwezig in twee neurogene hersenregio’s: de sub ventriculaire zone (SVZ) van de laterale ventrikels en de subgranulaire laag van de dentate gyrus. Stamcellen vertonen de karakteristieke eigens chappen van zelf-vernieuwing en de mogelijkheid om te differentiëren.&nb sp; De neuronale stamcellen staan volop in de wetenschappelijke belangst elling wegens de mogelijkheid om tot hier toe ondenkbare celtherapie aan te wenden voor het functionele herstel van hersenweefsel na trauma of d egeneratie. Neurogenese vereist specifieke instructies, geïnduceer d door de locale micro-omgeving op een ruitme- en tijdsafhankelijke mani er. Tegenwoordig is veel onderzoek gericht op het ontrafelen van d eze precieze regulatoire mechanismen onder normale en pathologische omst andigheden om te helpen in de ontwikkeling van nieuwe celtherapieë n. Genetische modificatie van neuronale stamcellen kan aangewezen zijn.& nbsp; Verschillende strategieën voor genetische manipulatie van neuronal e stamcellen in proefdierhersenen zijn mogelijk. Ons laboratorium is ges pecializeerd in de lentivirale vector (LV) technologie. LVs zijn vehicul a afkomstig van lentivirussen zoals het humaan immunodeficiëntie virus.& nbsp; Virale vectoren zijn genetisch gemodificeerd zodat virale sequenti es, noodzakelijk voor de inpakking en introductie van genetisch materiaa l in cellen, gescheiden worden van sequenties, noodzakelijk voor de leve ring van structurele proteïnes van het virale partikel. Dit result eert in een enkelvoudige infectie na transductie van de doelwitcellen zo nder virale replicatie. Ten opzichte van andere vectorsystemen, bi eden LVs de unieke mogelijkheid om hun genetisch materiaal stabiel te in tegreren in het DNA van zowel delende als niet-delende cellen. Bij de st art van mijn doctoraatsthesis was een kleinschalige vectorproductie faci liteit operationeel in ons laboratorium en was aangetoond dat LVs een st abiele langdurige genexpressie mediëren in knaagdierhersenen, een eigens chap die de ontwikkeling van locale, somatisch transgene diermodellen he eft mogelijk gemaakt. Echter, standaardisatie van groter opgezette diere xperimenten en uiteindelijk van klinische studies vereist de beschikbaar hied van grote hoeveelheden zuivere vector met een hoge titer. Sch aalvergroting van de LV productie werd verkregen door gebruik van serum- vrije celculturen in 10-lagige celfabriekjes, gevolgd door concentratie via tangentiële ultrafiltratie en ultracentrifugatie. Met deze nie uwe gestandaardizeerde methode werd 1 ml geconcentreerde vector, geschik t voor dierexperimenten, routinematig geproduceerd met titers van 109-10 10 TU/ml beginnende van twee liter celcultuur medium. In een tweede deelproject, hebben we geëvalueerd of deze vectoren aangewend ku nnen worden voor gentransfer in adulte neurale stamcellen van volwassen muizen. Injectie van LVs in de SVZ van muizen resulteerde in een e fficiënte en langdurige markergenexpressie in zowel immature neurale sta mcellen als in migrerende progenitorcellen. Na migratie en differentiati e, nam het aantal eGFP-positieve interneuronen in de ipsilaterale bulbus olfactorius toe in de tijd. Na intraventriculaire injectie van LVs, kon den we de gentransfer reduceren tot ependymale cellen en type B astrogli a-achtige stamcellen. In conclusie, LVs geproduceerd via de nieuwe, geop timaliseerde grootschalige vectorproductie en concentratiemethode kunnen gebruiklen. Dit onderzoek heeft het mogelijk gemaakt om lentivirale vecto r gemedieerde modulatie van neurogenese in volwassenen hersenen te gaan onderzoeken voor het basisonderzoek en voor de behandeling van neurodege neratie