高度好熱性細菌Thermus thermophilus HB8由来アラニンラセマーゼの大腸菌での発現，精製及び諸性質の検討

摘要

高度好熱性細菌Thermus thermophilus HB8由来アラニンラセマーゼ遺伝子を大腸菌中にクローニングし，発現させた後に，精製及び性質検討を行った．alr遺伝子は1080bpからなり360アミノ酸残基をコードしていたので，本酵素は38，596Daの分子量であると予想された．alr遺伝子の〔G＋C〕含量は，72%であり，Tm値は98.8℃であった．T．thermophilus HB8由来アラニンラセマーゼを中等度好熱性細菌Geobacillus stearothermophilus 及び赤痢菌Shigella sonnei由来のアラニンラセマーゼと一次配列の比較をしたところ，G.stearothermophilus 由来のものと33%，赤痢菌由来の酵素と28ワ石の相同性を示した．T．thermophilus HB8由来アラニンラセマーゼを，70℃で10分間の熱処理後，DEAEートーヨーパール陰イオン交換カラム等により精製した．精製酵素の最適温度は，D-アラニンからL-アラニンへの反応で55℃，L-アラニンからD-アラニンへの反応では60℃であり，最適pHは，9.0～10.0であった．また，70℃で30分インキュベートを行った後にも，活性の低下は見受けられず耐熱性を示した．更に，本酵素は分子量38，000のモノマー酵素であると推定され，その反応機構に興味が持たれる．%An alanine racemase (EC 5.1.1.1) from an extreme thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB8, was purified and characterized, and its gene was cloned. The cloned alanine racemase gene (alr) was expressed in Escherichia coli JM 109. The alr gene is composed of a 1080 bp and encoded a 360 amino acid, and was predicted to have a molecular weight of 38,596. The enzyme was purified by heat shock at 70℃ for 10min and DEAE Toyopearl 650M column chromatography. The purified enzyme had an optimum pH9.0～10.0 and an optimum temperature of 55℃~60℃. Enzyme activity was retained 100% after incubation of the enzyme at 70℃ for 10min. Alanine racemase from Thermus thermophilus HB8 is a monomeric enzyme with a molecular mass of 39 kDa.