稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系的构建

摘要

目的 构建稳定表达GFP-LC3的人急性单核细胞白血病细胞(THP-1).方法 采用pCDH-CMV-GFP-LC3-EF1α-puro转染293T细胞构建慢病毒质粒系统,获取的慢病毒感染THP-1细胞,用嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳定表达GFP-LC3蛋白的细胞系.通过Western blot和流式细胞术检测THP-1细胞中GFP-LC3蛋白的表达,并利用该稳定表达细胞系观察饥饿和雷帕霉素诱导时细胞发生的自噬变化.结果 筛选得到稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光.Western blot和流式细胞术检测证实了GFP-LC3融合蛋白的表达.激光共聚焦法和Western blot均证实饥饿和雷帕霉素可以诱导自噬的发生,且GFP-LC3融合蛋白可以反映内源LC3蛋白的变化,包括蛋白聚集和发生剪切修饰.结论 应用慢病毒质粒系统成功构建了高效稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系,从而为后续利用GFP-LC3融合蛋白研究自噬变化提供了细胞模型.