可诱导稳定表达大电导钙激活钾通道的细胞系构建及蛋白质纯化

摘要

目的:旨在构建稳定表达人大电导钙激活钾通道(BKCa)的稳定细胞系并对重组蛋白分离纯化.方法:利用基因工程技术将人肠系膜动脉平滑肌BKCa编码基因克隆到表达载体pcDNA5/FRT/TO/FLAG,并转染Flp-InTMT-RExTM-293宿主细胞,用潮霉素B筛选建立稳定表达的单克隆细胞系.BKCa-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后,用anti-FLAG抗体对表达的BKCa蛋白质进行纯化.用western blot检测BKCa通道蛋白质的表达,用单通道膜片钳检测通道的电生理特性.结果:BKCa-pcDNA5-293细胞系经四环素诱导后表达了高水平的BKCa-FLAG融合蛋白,BKCa通道电导值为213.39±9.52 pS(n=15,cell-attached)和225.72±10.61 pS(n=13,inside-out),BKCa通道具有典型的大电导特性、电压依赖性、Ca2+依赖性及IbTX敏感性,与在体的人肠系膜动脉平滑肌BKCa通道具有相同的特征.纯化后的BKCa蛋白质条带单一,纯度约为89%.结论:成功构建BKCa-pcDNA5-293细胞系并获得纯化的BKCa蛋白质,为进一步深入研究通道功能及药物筛选奠定了重要的基础.