人源性受磷蛋白稳定表达细胞系的构建

摘要

目的 构建稳定表达人源性受磷蛋白(phospholamban,PLN)的细胞系,并初步探索其在心肌毒性机制研究中的应用.方法 采用FastCloning方法将目的基因PLN的开放阅读框序列插入至真核表达载体pcDNA5/FRT/TO(以下简称pDFT),构建pDFT-PLN-Flag质粒,并与pOG44质粒共转染Flp-InTM T-RExTM 293细胞,实现目的基因的表达,通过潮霉素B抗性持续压力筛选出重组成功的单克隆细胞株.应用West?ern印迹法和间接免疫荧光法检验重组细胞目的蛋白的表达情况.对构建成功的细胞系进行乌头碱染毒后,通过Western印迹法,检测PLN磷酸化的变化.结果 重组质粒PCR扩增及DNA电泳后含有与已知PLN基因片段大小一致的扩增产物,测序后与人源性PLN基因开放阅读框(open reading frame,ORF)序列一致.间接免疫荧光法和Western印迹法提示构建的可增殖细胞系,诱导调控下可稳定且较高水平表达人源性PLN.乌头碱浓度为1μmol/L、染毒2 h时,PLN的Thr17位点磷酸化水平降低.结论 该人源性细胞株可以稳定表达PLN，并可用于乌头碱在分子水平上对细胞影响机制的研究.