猪β-内啡肽基因克隆和重组质粒壳聚糖修饰分子包装体外表达研究

摘要

目的 克隆猪β-内啡肽基因,研究其体外原核、真核表达,探索高效表达目的基因的新型纳米材料,为进一步研究β-内啡肽对动物免疫应答和应激调节等方面的作用奠定基础.方法 利用基因延伸重叠PCR克隆β-内啡肽的基因cDNA,双酶切后插入VR1020、pGEX-4T-1,构建其真核、原核表达载体；以不同浓度的IPTG诱导表达重组融合蛋白,并作SDS-PAGE和RT-PCR分析目的基因原核表达情况；利用壳聚糖及其修饰分子制备纳米颗粒包装重组真核表达质粒,体外转染HEK2.93细胞,提取总RNA进行RT-PCR分析β-内啡肽基因在真核细胞的表达.结果 成功克隆了猪β-内啡肽基因,并构建获得其原核和真核表达载体；不同浓度的IPTG诱导后,在29.7 kDa的位置出现了新的蛋白条带,而原来的26.2 kDa处的GST标签蛋白条带消失.说明目的基因已经和GST融合产生了新的融合蛋白；壳聚糖及其聚乙二醇和聚乙烯亚胺接枝修饰分子(mPEG-PEI-CS)纳米颗粒包裹VREP转染HEK293细胞,48 h后收集细胞,RT-PCR和ELISA检测显示VREP能够在HEK293细胞中高效地转录表达β-内啡肽.结论 本实验成功克隆了猪的β-内啡肽基因,并成功进行了原核及真核细胞表达分析,壳聚糖修饰分子纳米颗粒包装可高效表达目的基因,为进一步的动物实验奠定了基础.