检测石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒间接原位PCR方法的建立

摘要

[目的]建立能对石蜡切片中鸭病毒性肠炎病毒(DEV)核酸进行定位的原位PCR方法,为鸭病毒性肠炎(DVE)存档蜡块的回顾性诊断、致病机理研究等提供有效的实验手段.[方法]据DEV的UL30-UL31基因序列设计PCR 引物和寡核苷酸探针,以DEV感染死亡鸭肝脏组织石蜡标本制作切片,经蛋白酶K消化、原位PCR扩增和生物素标记的寡核苷酸探针原位杂交,建立了检测石蜡标本中DEV的间接原位PCR方法并应用于人工感染DEV不同时间的鸭肝脏、DVE发病鸭的存档蜡块和临床病料检测.[结果]间接原位PCR对DVE死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阳性,而鸭病毒性肝炎、鸭疫里默氏杆菌病、鸭多杀性巴氏杆菌病、鸭沙门氏菌病和鸭大肠杆菌病死亡鸭肝脏的石蜡标本检测结果为阴性;间接原位PCR对人工感染DEV后2、4、6、12、24、48和72 h不同时间的鸭肝脏检测结果均为阳性,阳性细胞有肝细胞、窦皮细胞和枯否氏细胞,阳性信号多出现于坏死细胞的碎片中或细胞坏死后形成的空泡内及空泡边缘;对存档蜡块、临床病料的检测与病毒分离鉴定吻合率为100%.[结论]本研究建立的间接原位PCR方法具有直观、敏感、特异性强的优点,在显示核酸阳性信号的同时,还能判别含有靶序列的细胞类型以及组织细胞的形态结构特征与病理变化.可用于OVE的诊断、分子流行病学调查、存档蜡块的回顾性诊断和致病机理的研究.