COX-2的基因克隆和多克隆抗体制备

摘要

环氧合酶-2(COX-2)是一种具有多种功能的神经调节物质,它的许多功能细节仍不十分清楚,还需要进一步深入研究.用PCR技术从大鼠脑cDNA文库中,扩增到正常成年大鼠COX-2的cDNA序列,测序结果与已发表的序列一致.通过PCR扩增和基因重组,分别构建COX-2编码基因全长和羧基端部分编码序列的表达载体,并导入大肠杆菌DH5α中, 通过IPTG诱导表达重组融合蛋白,结果导入全长编码基因表达载体的DH5α无COX-2融合蛋白表达,而羧基端部分基因编码的COX-2融合蛋白在DH5α中以包涵体的形式进行表达.经SD S-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析, 在相对分子质量(Mr)为44 000处有1条特异的蛋白质条带.对以包涵体形式表达的蛋白质进行变性、重折叠及纯化后,得到了高纯度融合蛋白.以重组融合蛋白免疫新西兰种大白兔,制作了抗COX-2多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹和免疫细胞化学方法检测,此抗体具有较高效价和特异性.COX-2基因和多克隆抗体的获得,为进一步研究COX-2 的功能创造了条件.