利用hTM表达细胞株制备抗人血栓调节蛋白单克隆抗体

摘要

为了研制抗人血栓调节蛋白(hTM)的单克隆抗体(mAb),给经CHO细胞免疫的BALB/c小鼠腹腔注射环磷酰胺诱导其对CHO和CHO-TM5细胞的共同抗原表位产生免疫耐受,再用高效表达hTM的CHO-TM5常规免疫小鼠.细胞融合后,ELISA筛选分泌抗hTM的特异性mAb阳性克隆,并将其腹腔注射BALB/c小鼠诱生腹水.腹水中的mAb经亲和层析纯化后,采用ELISA、流式细胞术、免疫组织化学染色法及westem blotting对其进行特异性鉴定.结果显示,共获得了5株阳性克隆,其中2F7可稳定分泌IgG1亚型的mAb,腹水抗体效价为1×10-6,含量为19.56 g/L.2F7在体内与正常组织的交叉反应极少,对HUVEC、CHO-TM5有特异性结合,并可识别细胞裂解液还原条件下分子质量为105 ku左右的蛋白质多肽.2F7的解离常数kd约为1.22×10-9mol/L.实验结果表明,通过采用新的技术路线,直接应用hTM表达细胞株免疫小鼠,成功制备了具有高度特异性与高亲和力的抗hTMmAb,为其他来源困难的蛋白质mAb制备提供了可借鉴的技术方案,同时2F7的研究鉴定为进一步应用抗hTM mAb进行hTM生物学功能及临床意义研究提供了新的物质基础.