金黄色葡萄球菌肠毒素SEK的纯化及DAS-ELISA检测方法的建立与应用

摘要

本研究目的为建立一种快速检测金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEK的双抗夹心酶联免疫吸附方法.将构建的原核表达载体pET-28a(+)-△NspSEK转化入BL 21 (DE3) pLysS细胞中诱导表达,经Ni2+-NTA亲和层析柱纯化获得重组SEK蛋白作为抗原.利用双抗夹心酶联免疫方法检测程序,确定抗SEK单克隆抗体及抗SEK多克隆血清的最佳稀释度,并使用该方法应用于检测SEK人工污染样品的加标回收率和茶多酚及乳酸链球菌素(Nisin)对7株sek阳性菌株的SEK蛋白分泌影响.结果 表明,原核表达载体得到可溶性表达,重组SEK蛋白分子量约为27.7 ku;建立的双抗夹心酶联免疫检测方法中,单克隆抗体最佳包被浓度为2.89 μg/mL、抗血清的最佳稀释度为1:500,回归方程为y=0.2165x+0.1627,相关系数R2=0.9993,最低检测限为0.1 μg/mL;检测SEK人工污染脱脂奶、LB肉汤和牛肉糜中的加标回收率高达97％以上;并且,采用建立的方法测得茶多酚和Nisin的添加浓度在其MIC及以下浓度时,茶多酚对7株sek阳性菌株蛋白分泌抑制效果更明显.