棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶Ⅰ的毕赤酵母多拷贝体系构建及其在高密度发酵中的表达

摘要

β-葡萄糖苷酶目前广泛应用于合成烷基糖苷、芳基糖苷和辅助纤维素酶水解纤维素.本研究将来自棘孢曲霉(Aspergilus aculeatus)的β-葡萄糖苷酶Ⅰ(ABGL)在毕赤酵母中通过构建多拷贝表达盒的方法实现高效表达,利用同尾酶Bgl Ⅱ/BamHⅠ反复酶切和用DNA连接酶连接的方法,成功构建了含多拷贝表达盒5'AOX-ABGL-TT的pHKA-(ABGL)3的分泌重组质粒,并线性化重组质粒转化毕赤酵母GS115,经过七叶苷显色筛选平板筛选获得高表达的GS115/pHKA-(ABGL)3菌株,且在50升发酵罐实现高密度发酵表达.研究表明,以pNPG为水解底物,在甲醇诱导120 h时摇瓶发酵液上清酶活可达83.15 U/mL,较之前报道的酶活提高了3.35倍;同时在50L发酵罐实现高密度发酵,在甲醇诱导120h时发酵罐上清酶活可达979 U/mL,较对照菌株的发酵罐上清液酶活提高2.94倍,且总蛋白表达量可以达到12g/L.