DNA-PKcs单链抗体DPK3-scFv的原核表达纯化及生物学作用研究

摘要

目的原核表达和纯化DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs）单链抗体DPK3-scFv,观察其透入细胞及干扰辐射诱发DNA-PKcs磷酸化修饰的生物学作用。方法 PCR扩增DPK3-scFv基因,插入到带有His标签的原核表达载体pET28a,重组质粒转化工程菌BL21、优化表达。免疫荧光显微镜和蛋白免疫印迹观察DPK3-scFv透膜进入HeLa细胞及对电离辐射诱发靶分子DNA-PKcs的磷酸化修饰的影响。结果成功构建单链抗体表达载体pET28a-DPK3-scFv,在2xYT培养基（16 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物和10 g NaCl溶于1 L双蒸水中,高压灭菌）、20℃温度、0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropy1-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG）条件下诱导可溶性表达,进一步获得了纯化单链抗体。DPK3-scFv能体外抑制DNA-PKcs激酶活性,纯化的DPK3-scFv可跨膜进入细胞内,并与DNA-PKcs共定位在细胞核。DPK3-scFv对γ射线照射HeLa细胞中DNA-PKcs及其S2056位点（pS2056）的自磷酸化具有显著抑制作用。结论通过优化条件获得了可溶性原核表达的DPK3-scFv单链抗体,具有抑制其靶分子DNA-PKcs的磷酸激酶活性。