人α-磷酸丙酮酸水合酶原核表达载体的构建及蛋白纯化

摘要

目的构建带PET-28a标签的人ENO1基因原核表达产物,观察其表达并纯化出带PET-28a标签的ENO1融合蛋白,为研究肿瘤糖酵解的相关机制奠定实验基础。方法以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增出ENO1基因编码片段,将其插入到PET-28a载体中,鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate,小量诱导表达后,利用PET-28a-琼脂糖凝胶4B亲和珠纯化PET-28a-ENO1融合蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹检测,获得纯度较好的PET-28a-ENO1蛋白。结果利用PCR技术从乳腺文库中扩增得到大小约1300 bp的目的基因片段,插入PET-28a载体中,经双酶切鉴定及测序,结果表明PET-28a-ENO1质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量（Mr）约为57×103的目的蛋白。结论成功获得了人糖酵解相关基因ENO1的原核表达产物,为进一步研究ENO1在糖酵解过程中的作用机制奠定基础。