叠氮溴化丙锭-荧光定量PCR法实时快速检测5种乳杆菌活菌数方法的建立与应用

摘要

[背景]乳杆菌属是发酵食品中最常见的微生物之一,与食品的品质和安全密切相关,定量检测乳杆菌活菌数、解析乳杆菌群落组成对发酵乃至肠道微生物等具有重要意义.[目的]建立一种在种水平上定量检测5种乳杆菌活菌数的叠氮溴化丙锭-荧光定量PCR(propidium monoazide-quantitative PCR,PMA-qPCR)检测方法并探讨其适用性.[方法]以植物乳杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌等发酵食品中常见的5种乳杆菌为目标菌株,查找并筛选特异性引物用于荧光定量PCR(qPCR)检测,优化叠氮溴化丙锭(PMA)处理条件,测定PMA-qPCR检测法的特异性、灵敏度及可靠性.最后利用PMA-qPCR法检测黄酒酿造过程中5种乳杆菌的活菌数.[结果]PMA最佳处理条件为:浓度20μmol/L下暗处理15min后曝光15min,此时可抑制样品中99.89％的死菌DNA扩增.该方法特异性高,能够准确识别5种乳杆菌;线性关系强,R2＞0.98;灵敏度高,检测限为101.8-103.2CFU/mL;重复性好,Cq值变异系数小于1％;与平板计数相比差异不显著(统计学上),P＞0.05.利用该方法检测黄酒中5种乳杆菌的活菌数,发现发酵乳杆菌、干酪乳杆菌和短乳杆菌是主要的乳杆菌(总计占比59％-89％),与已知黄酒酿造中乳杆菌群落组成相符.[结论]建立的PMA-qPCR法能够快速、准确地检测5种乳杆菌的活菌数,为解析样品中乳杆菌的实时组成及检测具有活性但不可培养(viable but nonculturable,VBNC)状态的乳杆菌提供了可靠的手段.