实时荧光RT-PCR快速检测猪瘟病毒的研究与应用Ⅰ.实时荧光RT-PCR检测猪瘟病毒方法的建立

摘要

本研究将荧光定量PCR技术与ABI定量检测系统相结合,建立了猪瘟病毒实时荧光RT-PCR快速检测技术.根据GeneBank上下载的29条国内外已测得的猪瘟全长序列、18条BVDV-Ⅰ和6条BVDV-Ⅱ全序列进行综合排列、比较,同时为保证猪瘟荧光探针的特异性,避开与BVDV同源部分,设计了5针对猪瘟病毒的特异性探针和引物.通过对5对探针和引物的筛选,反转录酶浓度、上下游引物浓度和探针浓度的进一步优化,建立了荧光RT-PCR检测猪瘟病毒的试验方法.在敏感度试验方面,与标准中的HCFA方法符合率为83％,较HCFA方法敏感,较常规套式PCR方法敏感100倍;在其它病原体的特异性试验中,其它病原的检出率均为零,该方法具有很强的猪瘟病毒特异性;在与进口一步法试剂Ready-To-Go RT-PCR Beads和常规Nest-PCR从反应时间、CT值表现、荧光增幅和反应耗费成本多方面比较中体现了荧光RT-PCR检测猪瘟病毒的优越性,初步建立了特异、灵敏、快速的猪瘟病毒实验室诊断方法.