大鼠miR-1慢病毒表达载体的构建与鉴定

摘要

目的 构建并鉴定大鼠miR-1慢病毒过表达系统.方法 采用EcoRⅠ酶双酶切将目的 基因从合成载体上酶切后连接入EcoRⅠ线性化慢病毒载体,连接产物转化后进行阳性克隆鉴定.成功构建的miR-1重组质粒与慢病毒辅助包装质粒及Lipofectamine 2000共转染293T细胞,产生慢病毒浓缩液并标定病毒滴度.重组慢病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),观察转染效率及miR-1表达水平.结果 测序结果显示目的 基因与Genebank序列完全一致;孔稀释法检测病毒滴度为3×108 TU/μL;以感染复数(MOI)50感染大鼠MSCs,感染效率达90%以上,聚合酶链反应显示miR-1高水平表达.结论 成功构建大鼠miR-1慢病毒表达载体并可高效转染大鼠MSCs,为进一步研究miR-1基因的相关功能提供了合适的载体.