大鼠IP3R1 miRNA慢病毒表达载体的构建及其沉默效应鉴定

摘要

目的 构建大鼠IP3R1 miRNA慢病毒表达载体,并利用PC12细胞株观察其对IP3R1基因的沉默效应.方法 根据已公布的IP3R1基因序列(GenBank No. NM_001007235),设计并合成4对miRNA的Oligo DNA(miRNA1、miRNA2、miRNA3和miRNA4),退火形成双链DNA后,与载体pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR连接,构建pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR-IP3R1表达载体;用Gateway技术将该表达载体先后与中间载体pDONRTM221、慢病毒载体pLenti6/V5-DEST连接,构建慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-IP3R1,包装产生慢病毒,收集上清,感染PC12细胞株,用Real-time PCR和Western blotting技术检测慢病毒表达载体对PC12细胞内IP3R1表达的沉默效应.结果 测序结果表明,4对pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-IP3R1表达载体序列与参考序列一致,将重组获得的慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-IP3R1转染至PC12细胞株,48h后IP3R1的mRNA和蛋白表达下调,以miRNA2和miRNA3的沉默效应最佳.结论 成功构建了大鼠IP3R1慢病毒表达载体pLenti6/V5-DEST-IP3R1,其可使大鼠PC12细胞株IP3R1表达下调,为利用RNA干扰技术进一步研究细胞内钙释放通道的功能奠定了基础.