慢病毒感染

摘要： 目的探讨PIWIL样蛋白2(PIWIL2)基因在肝母细胞瘤(hepatoblastoma,HB)中的表达及慢病毒介导的短发夹RNA敲低PIWIL2基因对HB细胞生物学行为的影响。方法收集2015年7月—2020年12月青岛大学附属医院小儿外科收治的33例HB患儿肿瘤组织及瘤旁正常组织标本,采用免疫组织化学方法检测两种组织中PIWIL2蛋白的表达。采用实时荧光定量PCR方法检测HB细胞HUH6与正常肝细胞LO2中PIWIL2 mRNA的表达。分别以shRNA-PIWIL2慢病毒和阴性对照慢病毒感染HUH6细胞,分为实验组和对照组,采用克隆形成实验、CCK-8实验、Transwell迁移实验检测两组细胞的增殖、迁移能力。结果HB肿瘤组织中PIWIL2蛋白表达水平显著高于瘤旁正常组织(t=7.16,P<0.05)。HB细胞HUH6中PIWIL2 mRNA表达水平显著高于正常肝细胞LO2(t=20.77,P<0.05)。与对照组相比,实验组细胞增殖能力减弱(t=7.62,F=17.68、165.40,P<0.05),细胞迁移能力降低(t=20.05,P<0.05)。结论PIWIL2在HB肿瘤组织及HB细胞HUH6中高表达,敲低PIWIL2能明显抑制HUH6细胞增殖,细胞迁移能力降低。

摘要： 目的构建大鼠micro RNA-133a-3P(miR-133a-3p)过表达及干扰慢病毒载体,筛选建立稳定表达miR-133a-3p的阴茎海绵体平滑肌细胞(CCSMC)稳转细胞株。方法原代及传代培养CCSMCs,并进行细胞免疫荧光染色鉴定。PCR技术扩增相应目的基因片段并进行酶切,回收后与目的基因连接,产物转化细菌感受态细胞,对阳性克隆测序行对比分析后,使用三质粒包装系统将含有目的基因的重组质粒和辅助包装质粒共转染至293T细胞进行慢病毒包装及纯化,并用荧光法测定病毒滴度。设置miR-133a-3p过表达组、miR-133a-3p干扰组、阴性对照组和空白对照组,在感染复数为10的条件下感染CCSMCs。倒置荧光显微镜下观察各组绿色荧光蛋白的表达情况,浓度为2μg·mL^(-1)嘌呤霉素筛选出稳定表达miR-133a-3p的CCSMCs。qRT-PCR检测慢病毒转染后CCSMCs内miR-133a-3p的表达。结果原代培养的大鼠CCSMCsα-SMA阳性细胞率达90%以上。经测序分析证实重组慢病毒构建正确;过表达及干扰慢病毒滴度分别为3×10^(8)和1×10^(9) TU·mL^(-1);qRT-PCR结果显示,与阴性对照组相比,miR-133a-3p过表达组miR-133a-3p的相对表达量增高,miR-133a-3p干扰组miR-133a-3p的相对表达量降低(P均<0.01)。结论本实验成功构建了miR-133a-3p过表达及干扰慢病毒表达载体,对大鼠CCSMCs进行转染和筛选后,可快速、高效、低成本获得过表达及干扰miR-133a-3p的稳转株。

摘要： 目的:探究过表达IL-24对乳腺癌细胞CXCR4表达及肿瘤细胞侵袭、迁移及凋亡的影响与机制。方法:免疫组织化学染色(IHC)检测乳腺癌与癌旁正常乳腺组织CXCR4与其配体CXCL12表达,并分析其相关性;Western blot检测CXCR4在人正常乳腺上皮细胞MCF-10A及乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453和MDA-MB-231中的表达;采用慢病毒稳转技术在乳腺癌细胞系MDA-MB-231中过表达IL-24,免疫荧光显微镜、RT-PCR和ELISA检测感染效率;将细胞分为5组:LV-IL-24组(感染过表达IL-24慢病毒)、LV-NC组(感染阴性对照慢病毒)、AMD3100组(采用CXCR4/CXCL12轴阻滞剂AMD3100进行培养)、LV-IL-24+AMD3100组(采用AMD3100进行培养的感染过表达IL-24慢病毒的细胞)、阴性对照组(正常培养的MDAMB-231细胞);Transwell、划痕实验和Annexin V-FITC细胞凋亡实验检测上述各组细胞侵袭、迁移及凋亡;Western blot检测各组细胞CXCR4、AKT与mTOR蛋白磷酸化水平及凋亡相关蛋白Bax与cleaved-Caspase-3表达。结果:CXCR4与CXCL12在乳腺癌组织中的表达均显著高于正常乳腺组织,且二者表达呈正相关;与MCF-10A细胞相比,CXCR4在乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-453及MDA-MB-231中表达明显增加(P<0.05),以MDA-MB-231最为显著(P<0.01)。转染过表达IL-24的慢病毒后,MDA-MB-231细胞IL-24 mRNA与蛋白表达均显著增加(P<0.05);与阴性对照组相比,LV-IL-24组、AMD3100组和LV-IL-24+AMD3100组细胞侵袭、迁移能力均显著降低(P<0.05),而凋亡率明显提高(P<0.05),LV-IL-24+AMD3100组变化最为显著(P<0.01);Western blot结果显示,与阴性对照组相比,LV-IL-24组、AMD3100组和LV-IL-24+AMD3100组细胞CXCR4、AKT与mTOR蛋白磷酸化水平显著降低(P<0.05),而凋亡相关蛋白Bax与cleaved-Caspase-3表达明显增加(P<0.05),LV-IL-24+AMD3100组变化最为显著(P<0.01)。结论:乳腺癌细胞中过表达IL-24可抑制CXCR4表达,通过下调PI3K/AKT/mTOR信号通路降低肿瘤细胞侵袭、迁移能力,促进其凋亡,联合使用CXCR4/CXCL12阻滞剂AMD3100可显著提高IL-24的上述抑癌效应。

摘要： 目的构建Seipin过表达PC12细胞株,探讨Seipin过表达后PC12细胞的凋亡情况。方法将PC12细胞分为正常组(未经任何处理的PC12细胞)、阴性组(不带Seipin过表达基因的慢病毒感染的PC12细胞株)和过表达组(带Seipin过表达基因的慢病毒感染的PC12细胞株);进行相应处理后培养24 h,采用荧光显微镜观察红色荧光基因(慢病毒携带的Seipin基因和空载体都包含了红色荧光基因)在细胞中的表达,采用Real time PCR检测BSCL2 mRNA表达水平,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL2-Associated X蛋白质(Bax)的表达水平;TUNEL染色观察细胞内断裂DNA情况。结果正常组未观察到红色荧光,阴性组和过表达组均出现红色荧光,感染效率>80%,提示成功构建Seipin过表达的PC12细胞株;Real time PCR结果显示,过表达组BSCL2 mRNA水平相较正常组和阴性组升高,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,过表达组Seipin蛋白表达水平高于正常组和阴性组、凋亡相关蛋白Bax低于正常组和阴性组,差异有统计学意义(P<0.01),TUNEL染色观察到过表达组细胞核荧光强度弱于正常组和阴性组。结论Seipin可能对PC12细胞有保护作用。

摘要： 目的 构建Seipin过表达PC12细胞株,探讨Seipin过表达后PC12细胞的凋亡情况.方法 将PC12细胞分为正常组(未经任何处理的PC12细胞)、阴性组(不带Seipin过表达基因的慢病毒感染的PC12细胞株)和过表达组(带Seipin过表达基因的慢病毒感染的PC12细胞株);进行相应处理后培养24 h,采用荧光显微镜观察红色荧光基因(慢病毒携带的Seipin基因和空载体都包含了红色荧光基因)在细胞中的表达,采用Real time PCR检测BSCL2 mRNA表达水平,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL2-Associated X蛋白质(Bax)的表达水平;TUNEL染色观察细胞内断裂DNA情况.结果 正常组未观察到红色荧光,阴性组和过表达组均出现红色荧光,感染效率>80％,提示成功构建Seipin过表达的PC12细胞株;Real time PCR结果显示,过表达组BSCL2 mR-NA水平相较正常组和阴性组升高,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,过表达组Seipin蛋白表达水平高于正常组和阴性组、凋亡相关蛋白Bax低于正常组和阴性组,差异有统计学意义(P<0.01),TUNEL染色观察到过表达组细胞核荧光强度弱于正常组和阴性组.结论 Seipin可能对PC12细胞有保护作用.

摘要： 目的 通过构建CRISPR/Cas9慢病毒载体,转染HSC-T6细胞,获得能稳定表达Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞,为后期的功能研究提供良好的工具和手段,为临床上治疗肝纤维化提供新策略.方法 设计合成COX-2基因特异性的sgRNA(COX-2-sgRNA-1、COX-2-sgRNA-2、COX-2-sgRNA-3),并将其连接至GV371载体上,提取重组后的质粒,将其与包装质粒共同转染到293T细胞,形成慢病毒颗粒,荧光法检测病毒滴度.按照MOI值计算病毒最适用量,先将Lenti-Cas9-puro转染至HSC-T6细胞,嘌呤霉素筛选得到HSC-T6-Cas9细胞,再用Lenti-COX-2-sgRNA-EGFP转染至HSC-T6-Cas9细胞获得HSC-T6-COX-2-/-细胞,通过Cruiser酶切检测及Western Blot等方法 在基因和蛋白水平上进行敲除验证.计量资料多组间比较采用方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验.结果 通过测序验证COX-2-sgRNA表达载体构建成功.重组表达质粒和包装质粒共同转染到293T细胞,形成慢病毒颗粒,荧光法检测病毒滴度均在1×108以上.成功构建能稳定传代的Cas9蛋白的HSC-T6细胞和COX-2基因缺陷的HSC-T6-COX-2-/-细胞模型.HSC-T6-Cas9细胞中LV-Cas9-Puro mRNA相对表达量(541.93±105.76)高于CON组细胞(1.00±0.02),差异具有统计学意义(t=12.995,P<0.01).通过Cruiser酶切检测及Western Blot试验,结果 提示CRISPR/Cas9慢病毒表达载体能在靶点起作用,其中COX-2-sgRNA-2敲除作用最明显,并且COX-2蛋白表达水平较CON组和NC组相比显著下降(P值均<0.05),提示COX-2-sgRNA有活性.结论 成功构建了针对COX-2靶基因的CRISPR/Cas9慢病毒载体,获得稳定的COX-2基因敲除的HSC-T6-COX-2-/-细胞.

摘要： 目的 观察维甲酸诱导2基因(RAI2)表达对胰腺癌生长的作用.方法 设计并合成成慢病毒RAI2过表达质粒和阴性对照慢病毒,并在胰腺癌细胞系SW1990中进行慢病毒感染实验建立RAI2过表达细胞株,然后利用荧光定量PCR检测RAI2 mRNA水平的表达验证过表达效率.利用裸鼠皮下移植瘤模型检测RAI2过表达组和阴性对照组细胞的生长,采用Student t检验进行统计学分析.结果 慢病毒感染1周后,RAI2过表达组SW1990细胞RAI2 mRNA的过表达率为(87.5±4.9)％,差异有统计学意义(t=-10.281,P＜0.01).裸鼠皮下移植瘤实验表明,与阴性对照组比较,RAI2过表达组肿瘤体积[(112.46±39.24)mm3比(544.85±94.43)mm3,t=6.585,P＜0.05]和重量[(90.83±46.53)mg 比(428.60±112.60)mg,t=7.325,P＜0.05]均低于阴性对照组.结论 RAI2基因表达上调抑制胰腺癌的生长.

摘要： 目的 :探讨小干扰RNA (small interference RNA,siRNA) Piezo1沉默质粒转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)来源外泌体对骨关节炎(osteoarthritis,OA)动物模型的作用。方法:选取雄性SD大鼠SPF级20只,月龄5.46~6.96(6.21±0.75)个月,体重385.76~428.66(407.21±21.45) g,提取大鼠的BMSCs,利用siRNA技术构建Piezo1的siRNA沉默质粒,慢病毒转染BMSCs后,提取外泌体。在细胞层面,根据是否转染siRNAPiezo1,将BMSCs分成空白质粒组和siRNA沉默质粒组,利用RT-PCR和Western blot法检测siRNA-Piezo1对BMSCs的成骨诱导能力。在动物模型层面,利用手术切除膝关节交叉韧带的方案制备OA动物模型,根据处理方案不同,将SD大鼠分为4组,空白对照组,模型组,BMSCs组和外泌体组。空白对照组大鼠不做处理;模型组大鼠切除交叉韧带后,构建OA动物模型;BMSCs组大鼠OA模型建成后,在CT引导下膝关节腔内注射BMSCs,细胞量为5×105个/ml,加载量2 ml,每周2次,持续4周;外泌体组大鼠OA模型建成后,加入siRNA-BMSCs来源的100μg外泌体,每周2次,持续4周。采用苏木精-伊红(HE)染色和番红-固绿染色检测动物模型的软骨情况,并用改良Minkin评分和国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International,OARSI)评分量化处理。反转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测软骨组织中多聚蛋白多糖(Aggrecan)Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ)的mRNA相对表达水平。结果:慢病毒转染效率为(92.11±4.22)%。RT-PCR结果显示,空白质粒组Piezo1 mRNA的相对表达量为1.07±0.06,与siRNA沉默质粒组0.31±0.01比较,差异有统计学意义(t=2.907,P<0.05)。HE染色和番红-固绿染色结果显示,空白对照组大鼠膝关节软骨结构存在,软骨面光滑。模型组大鼠膝关节结构已经完全破坏,BMSCs组大鼠膝关节软骨结构欠清晰,外泌体组大鼠膝关节软骨下骨成分存在。膝关节HE染色的改良Minkin评分结果和番红固绿染色的OARSI评分结果比较差异有统计学意义(F=15.903,19.005;P<0.05),外泌体组修复效果优于BMSCs组和模型组(P<0.05)。RT-PCR结果显示,BMSCs组中Aggrecan的mRNA相对表达量高于模型组(P<0.05),外泌体组中Aggrecan的mRNA相对表达量高于BMSCs组和模型组(P<0.05)。BMSCs组中CollagenⅡ的mRNA相对表达量高于模型组(P<0.05),外泌体组中CollagenⅡ的mRNA相对表达量高于BMSCs组和模型组(P<0.05)。结论:Piezo1 siRNA沉默载体可以促进BMSCs向软骨细胞分化,并且可以有效抑制OA的进展,延缓OA的病情。

摘要： 目的:探讨肾病综合征复发与慢病毒感染的关系.方法:通过对2010-2013年湖南省儿童医院肾内科初次诊断肾病综合征的患儿进行EB病毒(EBV)及巨细胞病毒(CMV)两种慢病毒感染检测,将其分为EBV感染组、CMV感染组、EBV+CMV感染组及非感染对照组,给予规律激素治疗,随访观察其对激素治疗的反应性及复发的表现,分析肾病综合征复发及激素治疗反应性与EBV及CMV感染的关系.结果:①共入选研究对象108例，EBV感染Ⅰ组28例，CMV感染Ⅱ组23例，EBV+CMV感染Ⅲ组14例，对照Ⅳ组43例，其中男73例，女35例。各组间性别无显著性差异(P＞0.05)。②规律激素治疗，四组4周尿蛋白转阴率分别为53.6%;52.1%;42.8%;51.1%,8周尿蛋白转阴率分别率17.8%;17.3%;21.4%;18.6%，激素抵抗率分别为28.6%;30.4%;28.5%;30.2%。阴转率及激素抵抗者各组间差异无显著性。③随访时间为3月一3年，失访4例，肾病综合症EBV感染复发率分别为43.8%;34.7%;35.7%;18.6%,Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅳ组组间比较均有显著性差异(P＜0.01)，Ⅰ组、Ⅱ组、Ⅲ组组间比较无显著性差异(P＞0.05)。结论:肾病综合征抵抗力低下，容易合并低毒力的慢病毒感染，但慢病毒潜伏感染容易导致肾病综合征的复发，但不影响激素对肾病综合征治疗反应的敏感。具体原因及依据仍需进一步研究。

摘要： 为构建分泌表达牛病毒性腹泻病毒(BVDV)E0蛋白MDBK细胞系,并探究其传代和冻存稳定性,本研究采用实验室制备的BVDVE0基因重组慢病毒感染MDBK细胞,荧光观察并收集MDBK细胞培养上清进行western blot分析,结果表明IgK信号肽组和预测信号肽组均分泌表达E0蛋白.通过Oligo6.0软件设计BVDV E0基因SYBR GreenⅠ染料法荧光定量PCR检测引物,经过条件优化,未出现非特异性扩增,检测下线为20拷贝/μL.通过建立的荧光定量PCR和流式分析对两组细胞系进行稳定性分析,传代稳定性分析结果表明,两组细胞系在第12代之后荧光率显著下降,15代之后E0基因拷贝数显著下降.两组细胞冻存前后荧光率未发现显著变化,因此本实验构建了稳定分泌表达BVDV E0蛋白的MDBK细胞系,建立了BVDV E0基因定量检测方法,为研究E0蛋白的生物学功能、探索BVDV的防控措施以及开发基因工程诊断抗原和基因工程亚单位疫苗的奠定了基础.

摘要： 目的：观察人色素上皮衍生因子(PEDF)对血管生成的抑制作用,探讨PEDF在肝癌基因治疗中的应用前景.rn 方法：构建色素上皮衍生因子慢病毒表达质粒pLenti-PEDF,经293T细胞包装,收集病毒上清液,感染肝癌细胞株HepG2.收集各组细胞的条件培养基,通过Westernblot分析各组细胞PEDF的表达情况,并通过人脐静脉血管内皮细胞增殖及迁移试验研究其体外生物学活性.人肝癌细胞HepG2移植到裸鼠皮下,研究Lenti-PEDF病毒对肝癌移植瘤生长的抑制作用,逆转录聚合酶链反应检测肿瘤组织中PEDF mRNA表达.多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法.rn 结果：限制性内切酶酶切分析和测序结果均表明成功构建了PEDF慢病毒表达载体,以293T细胞包装的重组慢病毒能够高效感染肝癌细胞,肝痛细胞感染重组慢病毒后可高效表达PEDF并分泌到培养上清液中.体外研究结果表明,重组PEDF可明显抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖及迁移,抑制率分别达29%和48%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P值均<0.01).Lenti-PEDF病毒能明显抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长(P<0.01).瘤内注射Lenti-PEDF病毒21 d后,逆转录聚合酶链反应在肿瘤组织检测到PEDF mRNA的过表达.rn 结论：本研究初步提示PEDF能有效遏制肿瘤的血管生成和肿瘤生长,为肝癌的基因治疗提供了一条新的思路.

摘要： 目的：观察人色素上皮衍生因子(PEDF)对血管生成的抑制作用,探讨PEDF在肝癌基因治疗中的应用前景.rn 方法：构建色素上皮衍生因子慢病毒表达质粒pLenti-PEDF,经293T细胞包装,收集病毒上清液,感染肝癌细胞株HepG2.收集各组细胞的条件培养基,通过Westernblot分析各组细胞PEDF的表达情况,并通过人脐静脉血管内皮细胞增殖及迁移试验研究其体外生物学活性.人肝癌细胞HepG2移植到裸鼠皮下,研究Lenti-PEDF病毒对肝癌移植瘤生长的抑制作用,逆转录聚合酶链反应检测肿瘤组织中PEDF mRNA表达.多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法.rn 结果：限制性内切酶酶切分析和测序结果均表明成功构建了PEDF慢病毒表达载体,以293T细胞包装的重组慢病毒能够高效感染肝癌细胞,肝痛细胞感染重组慢病毒后可高效表达PEDF并分泌到培养上清液中.体外研究结果表明,重组PEDF可明显抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖及迁移,抑制率分别达29%和48%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P值均<0.01).Lenti-PEDF病毒能明显抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长(P<0.01).瘤内注射Lenti-PEDF病毒21 d后,逆转录聚合酶链反应在肿瘤组织检测到PEDF mRNA的过表达.rn 结论：本研究初步提示PEDF能有效遏制肿瘤的血管生成和肿瘤生长,为肝癌的基因治疗提供了一条新的思路.

摘要： 目的：观察人色素上皮衍生因子(PEDF)对血管生成的抑制作用,探讨PEDF在肝癌基因治疗中的应用前景.rn 方法：构建色素上皮衍生因子慢病毒表达质粒pLenti-PEDF,经293T细胞包装,收集病毒上清液,感染肝癌细胞株HepG2.收集各组细胞的条件培养基,通过Westernblot分析各组细胞PEDF的表达情况,并通过人脐静脉血管内皮细胞增殖及迁移试验研究其体外生物学活性.人肝癌细胞HepG2移植到裸鼠皮下,研究Lenti-PEDF病毒对肝癌移植瘤生长的抑制作用,逆转录聚合酶链反应检测肿瘤组织中PEDF mRNA表达.多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法.rn 结果：限制性内切酶酶切分析和测序结果均表明成功构建了PEDF慢病毒表达载体,以293T细胞包装的重组慢病毒能够高效感染肝癌细胞,肝痛细胞感染重组慢病毒后可高效表达PEDF并分泌到培养上清液中.体外研究结果表明,重组PEDF可明显抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖及迁移,抑制率分别达29%和48%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P值均<0.01).Lenti-PEDF病毒能明显抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长(P<0.01).瘤内注射Lenti-PEDF病毒21 d后,逆转录聚合酶链反应在肿瘤组织检测到PEDF mRNA的过表达.rn 结论：本研究初步提示PEDF能有效遏制肿瘤的血管生成和肿瘤生长,为肝癌的基因治疗提供了一条新的思路.

摘要： 目的：观察人色素上皮衍生因子(PEDF)对血管生成的抑制作用,探讨PEDF在肝癌基因治疗中的应用前景.rn 方法：构建色素上皮衍生因子慢病毒表达质粒pLenti-PEDF,经293T细胞包装,收集病毒上清液,感染肝癌细胞株HepG2.收集各组细胞的条件培养基,通过Westernblot分析各组细胞PEDF的表达情况,并通过人脐静脉血管内皮细胞增殖及迁移试验研究其体外生物学活性.人肝癌细胞HepG2移植到裸鼠皮下,研究Lenti-PEDF病毒对肝癌移植瘤生长的抑制作用,逆转录聚合酶链反应检测肿瘤组织中PEDF mRNA表达.多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法.rn 结果：限制性内切酶酶切分析和测序结果均表明成功构建了PEDF慢病毒表达载体,以293T细胞包装的重组慢病毒能够高效感染肝癌细胞,肝痛细胞感染重组慢病毒后可高效表达PEDF并分泌到培养上清液中.体外研究结果表明,重组PEDF可明显抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖及迁移,抑制率分别达29%和48%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P值均<0.01).Lenti-PEDF病毒能明显抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长(P<0.01).瘤内注射Lenti-PEDF病毒21 d后,逆转录聚合酶链反应在肿瘤组织检测到PEDF mRNA的过表达.rn 结论：本研究初步提示PEDF能有效遏制肿瘤的血管生成和肿瘤生长,为肝癌的基因治疗提供了一条新的思路.

摘要： 目的：观察人色素上皮衍生因子(PEDF)对血管生成的抑制作用,探讨PEDF在肝癌基因治疗中的应用前景.rn 方法：构建色素上皮衍生因子慢病毒表达质粒pLenti-PEDF,经293T细胞包装,收集病毒上清液,感染肝癌细胞株HepG2.收集各组细胞的条件培养基,通过Westernblot分析各组细胞PEDF的表达情况,并通过人脐静脉血管内皮细胞增殖及迁移试验研究其体外生物学活性.人肝癌细胞HepG2移植到裸鼠皮下,研究Lenti-PEDF病毒对肝癌移植瘤生长的抑制作用,逆转录聚合酶链反应检测肿瘤组织中PEDF mRNA表达.多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法.rn 结果：限制性内切酶酶切分析和测序结果均表明成功构建了PEDF慢病毒表达载体,以293T细胞包装的重组慢病毒能够高效感染肝癌细胞,肝痛细胞感染重组慢病毒后可高效表达PEDF并分泌到培养上清液中.体外研究结果表明,重组PEDF可明显抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖及迁移,抑制率分别达29%和48%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P值均<0.01).Lenti-PEDF病毒能明显抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长(P<0.01).瘤内注射Lenti-PEDF病毒21 d后,逆转录聚合酶链反应在肿瘤组织检测到PEDF mRNA的过表达.rn 结论：本研究初步提示PEDF能有效遏制肿瘤的血管生成和肿瘤生长,为肝癌的基因治疗提供了一条新的思路.

摘要： 目的：观察人色素上皮衍生因子(PEDF)对血管生成的抑制作用,探讨PEDF在肝癌基因治疗中的应用前景.rn 方法：构建色素上皮衍生因子慢病毒表达质粒pLenti-PEDF,经293T细胞包装,收集病毒上清液,感染肝癌细胞株HepG2.收集各组细胞的条件培养基,通过Westernblot分析各组细胞PEDF的表达情况,并通过人脐静脉血管内皮细胞增殖及迁移试验研究其体外生物学活性.人肝癌细胞HepG2移植到裸鼠皮下,研究Lenti-PEDF病毒对肝癌移植瘤生长的抑制作用,逆转录聚合酶链反应检测肿瘤组织中PEDF mRNA表达.多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD法.rn 结果：限制性内切酶酶切分析和测序结果均表明成功构建了PEDF慢病毒表达载体,以293T细胞包装的重组慢病毒能够高效感染肝癌细胞,肝痛细胞感染重组慢病毒后可高效表达PEDF并分泌到培养上清液中.体外研究结果表明,重组PEDF可明显抑制人脐静脉血管内皮细胞的增殖及迁移,抑制率分别达29%和48%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P值均<0.01).Lenti-PEDF病毒能明显抑制人肝癌裸鼠皮下移植瘤的生长(P<0.01).瘤内注射Lenti-PEDF病毒21 d后,逆转录聚合酶链反应在肿瘤组织检测到PEDF mRNA的过表达.rn 结论：本研究初步提示PEDF能有效遏制肿瘤的血管生成和肿瘤生长,为肝癌的基因治疗提供了一条新的思路.

摘要： 本发明公开了一种shRNA片段。本发明还公开了一种含有所述的shRNA的重组质粒。本发明还公开了一种重组菌株。本发明还公开了一种重组质粒的构建方法和重组菌株的构建方法。本发明的细胞株遗传稳定性强，经过30次以上传代仍保留转入基因不发生丢失；本发明对于PPP2CA的敲低效果显著，可以有效降低其在mRNA和蛋白水平的表达；本发明细胞株具有良好的实验表型，阳性细胞株的增殖能力显著高于对照组细胞株。

摘要： 本发明公开了一种shRNA片段。本发明还公开了一种含有所述的shRNA的重组质粒。本发明还公开了一种重组菌株。本发明还公开了一种重组质粒的构建方法和重组菌株的构建方法。本发明的细胞株遗传稳定性强，经过30次以上传代仍保留转入基因不发生丢失；本发明对于PPP2CA的敲低效果显著，可以有效降低其在mRNA和蛋白水平的表达；本发明细胞株具有良好的实验表型，阳性细胞株的增殖能力显著高于对照组细胞株。

摘要： 本发明涉及一种慢病毒感染试剂及其制备方法与应用，慢病毒感染试剂包括第一组合物和第二组合物；第一组合物包括二油酰基L‑α‑磷脂酰乙醇胺；第二组合物包括聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；第一组合物和第二组合物分别独立包装。本发明提供的慢病毒感染试剂，创新地使用低毒性阳离子聚合物和非离子表面活性剂作为感染试剂，一方面可以降低传统感染试剂的细胞毒性，扩展感染试剂的使用范围，另一方面可以提高慢病毒感染效率和整合效率，感染效率和整合效率显著超过溴化己二甲铵，降低病毒使用量，降低制备成本，使用快速简便，具有很好的应用前景。

摘要： 本发明涉及一种增强携带CAR基因慢病毒感染人T细胞效率的新方法。CAR‑T技术被认为是最有可能治愈肿瘤的技术，尽管已经有了突破性的进展，然而在CAR‑T细胞制备方面仍存在一些瓶颈问题未解决，如T细胞的天然免疫反应使携带CAR基因的慢病毒感染T细胞效率低，这使得CAR‑T细胞制备效率低，成本高。针对如何提高携带CAR基因慢病毒感染T细胞效率的问题，申请人进行了一系列的实验及改进，发现用富马酸二甲酯(DMF)处理T细胞可以显著提高CAR慢病毒感染效率。本发明对大大提高CAR‑T细胞的制备效率，缩短CAR‑T细胞体外扩增的时间，降低CAR‑T疗法生产成本等方面具有指导意义和应用价值。

摘要： 本发明公开了一种提高细胞慢病毒感染率的增强感染培养基及方法，涉及MDA‑MB‑231细胞转染领域。增强感染培养基用于提高MDA‑MB‑231细胞慢病毒感染率，增强感染培养基的组分包括Leibovitz’sL‑15培养基、RPMI‑1640培养基、胎牛血清、非必需氨基酸和表皮细胞生长因子；按照总原料的体积百分比计算，所述胎牛血清的添加量为10％，所述非必需氨基酸的添加量为1％；所述表皮细胞生长因子的添加量为2～3ng/ml。通过采用本发明的增强感染培养基，MDA‑MB‑231细胞可以在37°C和5％CO2的常规环境下进行正常培养，且更为显著的提高了慢病毒对MDA‑MB‑231细胞的感染效率，使MDA‑MB‑231细胞基因编辑效率变得更高，解决了目前MDA‑MB‑231细胞慢病毒感染率低的问题。

摘要： 本发明提出了一种用于T细胞慢病毒感染的培养基。该培养基包括T细胞基础培养基以及人血清。发明人发现，所述培养基中添加人血清相比于添加胎牛血清，在提高慢病毒感染T细胞的效率方面，效果更加显著。根据本发明实施例的培养基用于慢病毒感染T细胞，在不增加病毒滴度(病毒量)的前提下，大大提高了病毒感染效率。

摘要： 本发明公开了一种慢病毒感染T细胞的方法。所述方法包括在感染体系中加入促感染试剂后培养；所述促感染试剂为dm PGE2；所述促感染试剂在所述感染体系中的终浓度为10μM～20μM。本发明筛选出一种安全有效的慢病毒促感染试剂及其最适浓度用于提高TCR的表达效率，dm PGE2(10～20μM)可以用于促进慢病毒感染CD8+T细胞，与常用的促感染试剂polybrene相比，可以显著提高慢病毒载体基因转导效率，增强T细胞的杀伤功能，而对于T细胞的分化表型没有影响。

摘要： 本发明涉及基因工程领域，特别是涉及CD4+T细胞系在慢病毒感染滴度检测中的用途及方法，所述CD4+T细胞系包括MT4细胞、C8166细胞或Jurkat细胞，所述Jurkat选自Jurkat‑E6细胞。本发明慢病毒感染滴度的检测方法包括如下步骤：将待测慢病毒接种到CD4+T细胞系的细胞悬液中，继续培养CD4+T细胞系，培养结束后检测所述待测慢病毒的感染滴度。本发明中使用的MT4等血液来源的CD4+白血病T细胞系对慢病毒感染的敏感性显著高于293T细胞系，其中MT4细胞系对同一慢病毒载体感染滴度的检测值比293T细胞系高5‑10倍，即更接近于待测慢病毒的真实感染滴度，可以用作精确测量慢病毒感染滴度的检测细胞系。

摘要： 本发明涉及一种增强携带CAR基因慢病毒感染人T细胞效率的新方法。CAR‑T技术被认为是最有可能治愈肿瘤的技术，尽管已经有了突破性的进展，然而在CAR‑T细胞制备方面仍存在一些瓶颈问题未解决，如T细胞的天然免疫反应使携带CAR基因的慢病毒感染T细胞效率低，这使得CAR‑T细胞制备效率低，成本高。针对如何提高携带CAR基因慢病毒感染T细胞效率的问题，申请人进行了一系列的实验及改进，发现用富马酸二甲酯(DMF)处理T细胞可以显著提高CAR慢病毒感染效率。本发明对大大提高CAR‑T细胞的制备效率，缩短CAR‑T细胞体外扩增的时间，降低CAR‑T疗法生产成本等方面具有指导意义和应用价值。

摘要： 本发明涉及一种慢病毒感染试剂及其制备方法与应用，慢病毒感染试剂包括第一组合物和第二组合物；第一组合物包括二油酰基L‑α‑磷脂酰乙醇胺；第二组合物包括聚氧乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物；第一组合物和第二组合物分别独立包装。本发明提供的慢病毒感染试剂，创新地使用低毒性阳离子聚合物和非离子表面活性剂作为感染试剂，一方面可以降低传统感染试剂的细胞毒性，扩展感染试剂的使用范围，另一方面可以提高慢病毒感染效率和整合效率，感染效率和整合效率显著超过溴化己二甲铵，降低病毒使用量，降低制备成本，使用快速简便，具有很好的应用前景。