大鼠ILK-RNAi慢病毒表达载体的构建及鉴定

摘要

目的 构建大鼠整合素连接激酶-RNAi(ILK-RNAi)慢病毒表达载体,为下一步干预研究细胞转分化及其信号通路奠定基础.方法 针对大鼠ILK基因RNAi有效靶序列,合成4条干扰(KD)序列.与pGCSIL-GFP载体连接产生shILK-RNAi慢病毒载体.将连接产物转入制备完毕的细菌感受态细胞,PCR鉴定阳性克隆,测序验证.包装慢病毒,以绿色荧光蛋白(GFP)表达水平验证病毒滴度.慢病毒载体感染大鼠NRK-52E细胞后,RT-PCR、WB检测及荧光显微镜观察ILK在其细胞中的表达.结果 测序验证成功构建3条大鼠ILK-RNAi慢病毒载体,滴度分别为5×108,2.5×108,3.5×108 pfu/mL.分别以不同感染复数(MOI)感染NRK-52E细胞进行内源筛靶,荧光观察80％细胞的绿色荧光蛋白,RT-PCR、WB检测ILK的表达明显下降.相对于阴性对照序列,KD2,KD3在高MOI组中对ILK表达的敲减达到65％以上(P＜0.05),为有效靶点.其中KD2及KD3的ILK 2-△△ct值分别为0.337,0.217.KD2序列为对ILK的表达抑制最显著.结论 成功构建大鼠ILK-RNAi慢病毒表达载体.