果糖基转移酶AoFT在毕赤酵母中的表达与纯化及其酶学性质研究

摘要

利用基因工程技术方法,将构建的重组质粒pPICZαA-AoFT线性化后,经电转化导入毕赤酵母X33(Pichia pastoris X33)中,构建重组毕赤酵母工程菌pPICZαA-AoFT/X33,实现果糖基转移酶AoFT在毕赤酵母中的表达,进而研究纯化后的果糖基转移酶AoFT的酶学性质.结果表明:pPICZαA-AoFT/X33随发酵时间的增加而快速繁殖,菌体OD600值于发酵时长120 h时达到峰值,此时发酵液胞外总蛋白质量浓度为1.64 mg/mL;纯化后的果糖基转移酶AoFT的比活力为71.4 U/mg,产率达70.6%;PNGase F酶切反应证实纯化后的果糖基转移酶AoFT发生了N-糖基化反应;果糖基转移酶AoFT的最适反应温度为45℃,最适缓冲体系为醋酸钠缓冲液(pH值为4.5~6.0);金属离子Mn2+,Ca2+对果糖基转移酶AoFT具有激活作用,而Al3+,Fe2+,Ni2+,Zn2+和EDTA对果糖基转移酶AoFT具有抑制作用;表面活性剂SDS,吐温20和Triton X-100对果糖基转移酶AoFT的酶活性影响较小,还原剂DTT对果糖基转移酶AoFT的酶活性具有明显的抑制作用,酶抑制剂PMSF低浓度时对果糖基转移酶AoFT的酶活性无显著影响,高浓度时可使酶活性降低;果糖基转移酶AoFT对有机溶剂乙醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、正丁醇、正己烷和甲苯具有较强的抗性.