RNA干扰热休克蛋白90α表达对NIH-3T3细胞应激反应的影响

摘要

目的 用RNA干扰方法建立稳定的热休克蛋白90α(HSP90α)抑制表达细胞株,研究热休克蛋白90α抑制表达对细胞应激反应的影响.方法 将人Hsp90αRNA干扰基因片段连接入pSilencer2.1-U6neo载体,重组质粒pSilencerHSP90经亚克隆、纯化、测序鉴定后,用电穿孔法转染到小鼠成纤维细胞系NIH-3T3细胞内.经G418筛选、克隆分离培养,用免疫荧光、免疫印迹鉴定阳性克隆.用高温作用(44℃,40 min)模拟氧化应激环境,以NIH-3T3细胞为对照,流式细胞仪测定DNA受损细胞数,分析在细胞应激状态下对细胞膜和DNA的损害及HSP90低表达对细胞应激反应的影响.结果 转染pSilencerHSP90的NIH-3T3细胞Hsp90免疫荧光染色减弱,主要分布于胞浆;与对照相比,44℃,40 min时DNA的损害加重(9.2%vs18.5%,P＜0.01).结论 建立稳定低表达HSP90αNIH-3T3细胞株;热休克蛋白90表达与其应激保护作用密切相关.