促凋亡分子Bad真核表达载体构建及其在人基底细胞癌细胞中的表达

摘要

目的:克隆Bcl-2相关促凋亡基因Bad的全长编码序列,构建Bad基因的真核表达载体并在人基底细胞癌细胞系(A431)中表达,为研究该基因在人基底细胞癌治疗中的作用奠定基础.方法:根据已发表的Bad基因的核苷酸序列设计并合成引物,用Hela细胞抽提的RNA进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),扩增产物用XhoI和EcoRI双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc中,用限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3.1-myc-Bad并对其DNA测定序列.用脂质体法将pcDNA3.1-myc-Bad导入人基底细胞癌细胞系A431中,G418选择培养, Western blot及SABC-FITC 分析鉴定其表达.瞬时转染A431细胞,通过细胞计数和集落形成实验观察其对A431细胞生长的影响.结果:RT-PCR扩增出长500 bp的特异性片段,经克隆至pcDNA3.1-myc后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank报道完全一致.pcDNA3.1-myc-Bad在A431细胞中有表达并可影响细胞生长,与对照组有明显差异.结论:成功克隆了Bad的编码序列,构建了其真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc-Bad,并在瞬时转染肿瘤细胞后观察到细胞生长受抑制.