Bad基因的克隆、表达及其对人基底细胞癌A431细胞促凋亡作用的实验研究

摘要

基底细胞癌(basalcellcarcinoma，BCC)，又称基底细胞上皮瘤，是颜面部皮肤最常见的恶性上皮性肿瘤，以面中部多见。本病发展缓慢，很少发生转移，治疗主要采用外科切除的方法，但手术治疗后遗留的面部畸形将给患者带来沉重的心理负担，严重影响患者的术后生存质量。近年来，基底细胞癌的发病率逐渐升高，引起学术界的广泛关注。细胞凋亡与肿瘤的发生密切相关，由于癌基因激活或抑癌基因失活导致的细胞周期失控，细胞凋亡不足，是许多肿瘤发生的重要机制。近年来，随着人们对细胞凋亡机制进一步深入的了解，越来越多的研究者试图通过诱导肿瘤细胞凋亡来治疗癌症，并取得了初步成效。基因治疗，就是将某种遗传物质转移到患者细胞中，使其在患者体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。基因治疗作为一种新的肿瘤治疗手段越来越引起医学界的重视。 Bcl-2家族是细胞凋亡的重要调节分子，包括Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad、Bak、Bag-1、Bik、Bok、Bim、GRS、Bfl-1、Hrk、Al、Mcl-1、BHRF-1等，目前还不断有新基因被发现。该家族成员的共同特点是由4个保守序列BH1、BH2、BH3和BH4，这些保守序列对于Bcl-2家族成员间的结合与发挥各自的作用极为重要，其中BH1和BH2对于抗凋亡蛋白如Bcl-2的结合能力及抗凋亡作用很重要，而BH3对于凋亡蛋白Bax和Bak等至关重要。另外，Bcl-2家族蛋白的C端都含有一段疏水氨基酸链，使其能与细胞内膜结合。它们可形成同源或异源二聚体，其中一些诱导凋亡，另一些阻止凋亡发生，如Bcl-2亚家族(包括Bcl-2、Bcl-xl等)，能够抑制细胞凋亡的发生，而Bax亚家族(如Bax、Bak等)，和BH3亚家族(Bad、Bid等)则促进细胞的凋亡。Bad(Bcl-2-antagonistofcelldeath)1995年被发现，编码168个氨基酸，与Bcl-2家族的同源性较低，在凋亡过程中，表现为促进细胞凋亡。在凋亡过程中，Bad依靠自身的强结合力，以浓度依赖性的方式替换Bcl-2/Bax、Bcl-xl/Bax异二聚体中的Bax，使Bax游离后形成同源二聚体而促进细胞凋亡。 本研究根据GenBank中Bad基因序列设计引物，在上下游引物中分别引入XhoI和EcoRI的酶切位点，扩增包括目的基因的序列，利用酶切连接使目的基因正确插入真核表达载体pcDNA3.1-myc、pEGFP-C3，进行酶切鉴定和基因测序，表明序列与GenBank报道完全一致，成功构建了Bad真核细胞表达载体pcDNA3.1-myc-Bad、pEGFP-C3-Bad。利用脂质体转染方法转染A431细胞系，体外实验观察该基因对A431细胞的促凋亡作用。分别以重组载体pcDNA3.1-myc-Bad和pEGFP-C3-Bad、空载体瞬时转染A431细胞，可观察到目的基因的表达。间接免疫荧光可观察到实验组细胞死亡增多，并出现细胞形态的改变。细胞计数观察到实验组存活细胞数目减少。流式细胞仪检测细胞凋亡，观察到实验组早期凋亡率较空载体组明显增高，表明Bad基因的表达产物对A431细胞具有促凋亡作用。pcDNA3.1-myc-Bad转染A431细胞并以G418筛选出稳定转染阳性克隆，利用RT-PCR在RNA水平、利用WesternBlot在蛋白表达水平检测到目的基因的表达产物。克隆形成实验发现，实验组克隆形成率明显降低。真核细胞表达载体的成功构建为进一步研究Bad基因的结构和功能提供了实验依据，为研究凋亡诱导基因在人基底细胞癌的基因治疗中的可行性奠定了基础。

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略语表

前 言

第一部分细胞凋亡及其调控

第二部分基底细胞癌概述

第三部分Bcl-2家族和Bad基因

实验材料

实验方法

实验结果

讨 论

全文总结

参考文献

个人简历以及硕士在读期间发表的论文

致 谢