丝状真菌里氏木霉中shRNA沉默红色荧光基因

摘要

报道了在里氏木霉中建立的一种以红色荧光蛋白(DsRed)为报告基因的RNA干扰方法.首先,将构建的表达DsRed质粒pANRed1转化里氏木霉QM9414,得到抗潮霉素B抗性并能稳定表达DsRed的菌株DsRed-T.reesei.其次,以丙酮酸脱氢酶启动子Ppdc和纤维二糖水解酶Ⅰ终止子cbh Ⅰ为原件,克隆到载体pPHL上构建质粒pPHL-Ppdc-Tcbh1.根据DsRed基因序列设计特定的siRNA干扰序列和另一条无同源序列的siRNA作为阴性对照,克隆到栽体pPHL-Ppdc-Tcbh1得到重组质粒.将其转化到DsRed-T.reesei中,用含有100 μg/mL潮霉素B和250 μg/mL腐草霉素的PDA平板筛选转化子.结果表明,约79％的转化子出现红色荧光沉默现象,其中一些转化子DsRed的表达几乎完全被抑制.荧光定量PCR和Western印迹分析显示DsRed基因的表达受到不同程度的下调.以上结果提示,在里氏木霉中可用此方法研究基因表达调控.