通过shRNA介导的KIR2DL3基因沉默研究NK细胞体外抑制HCV复制活性与KIR2DL3基因的关系

摘要

目的：
　　本实验通过shRNA对NK细胞KIR2DL3基因进行表达沉默，研究NK细胞体外抑制HCV复制活性与KIR2DL3基因的关系，并对其作用机制进行初步探讨，以期为HCV的感染机制认识及免疫治疗提供新思路。
　　方法：
　　首先，设计针对KIR2DL3基因mRNA的shRNA,通过梯度降温合成shRNA双链，并利用shRNA两侧的粘性末端与线性PLKO.1载体的粘性末端互补结合而将shRNA片段插入PLKO.1载体中，并通过脂质体转染方法将表达载体与PSPAX2、PMD2G两种辅助质粒共转染到293T细胞，获得慢病毒，用慢病毒感染NK细胞，实现NK细胞KIR2DL3基因表达的沉默，并用western-blot检测NK细胞KIR2DL3的沉默效率。
　　之后我们利用pFL-J6/JFH-1质粒转录出HCV-RNA，纯化HCV-RNA，通过脂质体转染法将HCV-RNA与Huh7.5.1细胞转染,收集HCV病毒颗粒。然后利用磁珠分选技术分选健康人CD4+T细胞，利用HCV病毒颗粒感染人CD4+T细胞，制备HCV体外培养方法，RT-PCR检测CD4+T细胞的HCV表达。提取6例携带KIR2DL3基因，并且HCV抗原抗体阴性受试者的NK细胞及CD4+T细胞，将沉默KIR2DL3基因的NK细胞、未沉默KIR2DL3基因的NK细胞分别与感染HCV的自体CD4+T细胞（HCV-CD4+T细胞）共同孵育24小时，RT-qPCR检测CD4+T细胞内HCV-RNA相对含量。
　　结果：
　　本实验可以包装出稳定的针对KIR2DL3基因的具有感染性的慢病毒。NK细胞感染慢病毒后，KIR2DL3表达水平明显降低，沉默效率约80％。
　　利用脂质体转染方法通过Huh-7.5.1细胞可成功制备出HCV体外培养系统，产生稳定的HCV病毒颗粒，可成功感染人CD4+T细胞。与未沉默KIR2DL3基因的NK细胞相比，沉默KIR2DL3基因后的NK细胞与CD4+T细胞共同孵育后，CD4+T细胞HCV相对含量减少更明显，提示沉默KIR2DL3基因后的NK细胞具有更强的杀伤活性。
　　结论：
　　通过shRNA可以成功实现NK细胞KIR2DL3基因沉默。通过NK细胞KIR2DL3基因沉默前后对HCV-CD4+T细胞中HCV相对含量影响的对比，可初步判断，沉默KIR2DL3基因的NK细胞具有更强的HCV清除趋势。

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缩 略 语 表

引言

第一章

1.1主要实验材料

1.2构建针对KIR2DL3基因的shRNA及shRNA慢病毒载体

1.3 包装针对KIR2DL3基因的慢病毒

1.4 shRNA沉默NK细胞的KIR2DL3基因

1.5 结果

1.6 讨 论

第二章

2.1主要实验材料

2.2建立体外感染HCV的CD4+T细胞模型

2.3 沉默KIR2DL3的NK细胞体外抑制HCV-CD4+T细胞复制活性研究

2.4结 果

2.5讨 论

结论

问题与展望

致谢

参考文献

附录

附录一 技术路线图

附录二 综述: KIR2DL3/HLA-C1基因组合与HCV感染相关性研究进展

附录三 读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

声明