基于易错PCR的β-甘露聚糖酶体外分子定向进化研究

摘要

采用易错PCR方法,对β-甘露聚糖酶进行体外分子定向进化,通过调整dNTP比例和加入不同浓度的Mn2+,向β-甘露聚糖酶中随机引入突变,构建突变文库,并对筛选得到的突变菌株的突变酶酶学性质进行研究.结果表明:在突变文库的构建过程中,当Mn2+浓度为0.01 mmol/L时,阳性转化率最高,达到80%,氨基酸的突变个数为2.0个,符合易错PCR突变文库的构建原则;经过两轮易错PCR构建的突变文库库容量约为4000,从中筛选出的突变毕赤酵母菌X-33/pGAPZαA-GwMan26A-27的突变酶GwMan26A-27具有耐酸、耐高温且酶活力较高的特性;与突变前相比,GwMan26A-27具有较宽的酶促反应温度范围和适宜pH值范围,热稳定性和pH稳定性均有较大提升;在胃蛋白酶液和胰蛋白酶液中水浴2 h,GwMan26A-27的消化酶稳定性较突变前也均有所提升.