易错PCR

摘要： 以分子伴侣skp修饰的蒙古黄芪病程相关蛋白AmPR-10(Astragalus membranaceus pathogenesis-related protein-10)全基因为模板,通过易错PCR定向进化技术构建突变体文库,以酵母tRNA为底物建立高通量筛选方法,获得了核酸酶活性提高的AmPR-10突变体。经一轮定向进化后,突变体A4的核酸酶活性比野生型提高45%;测序结果显示,突变体A4基因序列在465位增加了1个碱基A,进而由移码突变引起了多肽序列的提前终止,使得突变体A4 C末端缺失了3个氨基酸;从空间上看,AmPR-10基因的突变减小了其C末端α螺旋对空腔的遮蔽作用,有利于目的蛋白与配体或底物的结合。该研究结果对AmPR-10核酸酶活性机制的探讨具有重要意义,为抗病抗逆黄芪植株的培育奠定了理论基础。

摘要： 为了改造黑曲霉(Aspergillus niger)来源的β-甘露聚糖酶ManA,获得耐热性高的突变体。利用易错聚合酶链式反应(PCR)技术对构建的表达质粒pGAPZαA-manA进行随机突变,将突变文库转化至毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,表达筛选耐热性高的突变体,并进一步对突变位点进行定点突变,筛选其他耐热性高的突变体。结果表明,ManA的H283R与H283K突变体相对于野生型在耐热性方面有显著提升,75°C加热30 min其相对酶活由26.66%分别提升至76.95%和83.57%;在pH 3.0~9.0的条件下,50°C保存24 h,H283K突变体与野生型的相对酶活均在90%以上,H283R突变体在pH 3.0时的相对酶活下降到了84.72%,两个突变体的最适温度、pH及比酶活与野生型没有明显差异。说明β-甘露聚糖酶ManA的283位组氨酸(H283)对其耐热性较为关键,将该位点突变为精氨酸(R)和赖氨酸(K)时,ManA的耐热性得到显著提升。

摘要： 葡萄糖二酸是一种在医药、食品、服装纺织和化工均有重要作用的有机二元酸。葡萄糖二酸的生物合成途径已经在大肠杆菌、毕赤酵母和酿酒酵母细胞中成功构建。为了提高葡萄糖二酸合成关键酶-肌醇加氧酶MIOX4的活性,该研究以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为底盘微生物,通过定向进化-易错PCR的方法对来自拟南芥基因组的肌醇加氧酶MIOX4的关键氨基酸序列进行随机突变。以葡萄糖二酸的产量为筛选指标,利用大肠杆菌葡萄糖二酸传感器对MIOX4的突变体进行高通量筛选。实验结果显示,从突变体文库中筛到4株有潜力的MIOX4突变体(S133R、K88R、E72V、T40P),使得葡萄糖二酸产量相较于未突变菌株分别提高了53%、30%、21%、17%。通过对突变体MIOX4(S133R)进行结构分析,发现突变位点R133增大了该位点与底物肌醇之间的空间距离,从而减少了空间位阻,提高了对底物肌醇的催化能力。该研究为后续研究MIOX的结构和功能、以及进一步提高葡萄糖二酸产量奠定了基础。

摘要： 为构建一株高效表达内切β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母菌株,并用于水解热凝胶生产β-1,3-葡寡糖.作者首先对哈茨木霉来源内切β-1,3-葡聚糖酶基因进行随机突变,并构建BGN13.1a突变库;然后采用高通量技术及刚果红平板筛选高表达菌株;最后采用TLC薄层色谱和MALDI-TOF MS分析热凝胶水解产物,并分析了酶学性质.结果表明,本研究成功筛选得到毕赤酵母突变株K827,酶活较初始菌株提高了 25％;其水解产物聚合度为2～10,且寡糖产量为1.492 g/L;其最适pH与最适温度分别为5.5和50°C;相较亲本酶,突变株K827的pH稳定性与温度稳定性都有明显提高.本研究为内切β-1,3-葡聚糖酶的工业化生产及应用提供依据.

摘要： 氨基转移酶催化L-氨基酸和α-酮酸之间的氨基转移.TLC(薄层层析)和甲臜颜色反应检测大肠杆菌4种氨基转移酶(TyrAT、IlvAT、AspAT和AvtAT)催化6种非天然氨基酸的转氨活性,发现AvtAT和AspAT无非天然氨基酸转氨活性.TyrAT能催化DL-高苯丙氨酸、L-正亮氨酸和L-正缬氨酸的转氨反应,而IlvAT则催化DL-高苯丙氨酸、L-正缬氨酸、L-正亮氨酸、L-叔亮氨酸和L-新戊基甘氨酸的氨基转移.使用易错PCR突变和DL-高苯丙氨酸/L-正亮氨酸作氮源定向进化筛选,获得10个不同位点突变的TyrAT突变酶.酶活分析发现,这些突变酶虽酶活不同但尚未扩展TyrAT的非天然氨基酸底物特异性.10个突变酶中,每个酶蛋白210位都出现Cys替换Phe.与野生型酶比较,TyrAT的F210C突变明显改变酶的催化最适温度并且提高酶在37°C的催化效率.

摘要： 根据阳性转化子在IPTG诱导下可以在LB-CMC平板上产生水解圈的原理,在初筛和摇瓶复筛的基础上,采用易错PCR法对β-1,4-葡聚糖内切酶基因进行定向进化,从阳性转化子中筛选酶活提高的突变菌株.突变酶活性是野生酶的1.32倍,催化效率约为野生酶的1.26倍.基因测序结果表明,突变酶基因DNA序列中有3个碱基发生了突变,导致氨基酸序列中有2个氨基酸发生了改变:野生酶突变位点的密码子AAA(106 bp)突变为GAA,其编码的赖氨酸变为谷氨酸;野生酶突变位点的密码子TTT(1760 bp)突变为TCT,其编码的苯丙氨酸变为赖氨酸;野生酶突变位点的密码子GGT(1962 bp)突变为GGC,但是其编码的氨基酸没有发生改变,为同义突变.

摘要： 采用易错PCR方法,对β-甘露聚糖酶进行体外分子定向进化,通过调整dNTP比例和加入不同浓度的Mn2+,向β-甘露聚糖酶中随机引入突变,构建突变文库,并对筛选得到的突变菌株的突变酶酶学性质进行研究.结果表明:在突变文库的构建过程中,当Mn2+浓度为0.01 mmol/L时,阳性转化率最高,达到80％,氨基酸的突变个数为2.0个,符合易错PCR突变文库的构建原则;经过两轮易错PCR构建的突变文库库容量约为4000,从中筛选出的突变毕赤酵母菌X-33/pGAPZαA-GwMan26 A-27的突变酶GwMan26 A-27具有耐酸、耐高温且酶活力较高的特性;与突变前相比,GwMan26 A-27具有较宽的酶促反应温度范围和适宜pH值范围,热稳定性和pH稳定性均有较大提升;在胃蛋白酶液和胰蛋白酶液中水浴2 h,GwMan26A-27的消化酶稳定性较突变前也均有所提升.

摘要： [目的]探究环境中同时存在低浓度四环素(tetracycline,TC)和3,4-苯并芘(benzo [a] pyrene,Bap)对抗性基因tetA(C)产生高抗性突变的影响.[方法]以大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)为宿主菌株,pACYC 184质粒作为载体,四环素抗性基因tetA(C)作为研究对象,采用易错PCR构建基因文库的方法,建立基因突变位点对应高抗性的关系密码表.同时设置添加低浓度TC且添加0-30 mg/L Bap以及仅添加0-30 mg/L Bap的处理组,培养携带pACYC184质粒的大肠杆菌14d,每组中随机挑选10株获得高抗性的菌株,对其中的tetA(C)基因片段进行测序,再结合突变位点密码表,计算高抗性菌株中由基因突变产生高抗性菌株的比例.[结果]测序结果显示在低浓度TC选择压力下,Bap浓度越高时,高抗性基因突变株占的比例也越高(P≤0.01),而不添加TC时,Bap浓度与高抗性基因突变株占比之间无变化规律(P＞0.05).[结论]当环境中同时存在Bap和低浓度TC时,高抗性突变基因易于通过选择压力保存下来.

摘要： 本文为提高透明颤菌血红蛋白在限氧条件下促进宿主细胞生长的能力,首先通过易错PCR向透明颤菌血红蛋白基因中引入突变,再结合DNA改组对之进行改造。本研究将易错PCR与oHn改组相结合，对VHb进行改造，并将突变基因置于受氧调控的启动子之下进行表达和筛选，来筛选在限氧条件下比YHb具有更强生长促进作用的突变蛋白。

摘要： 本文为提高透明颤菌血红蛋白在限氧条件下促进宿主细胞生长的能力,首先通过易错PCR向透明颤菌血红蛋白基因中引入突变,再结合DNA改组对之进行改造。本研究将易错PCR与oHn改组相结合，对VHb进行改造，并将突变基因置于受氧调控的启动子之下进行表达和筛选，来筛选在限氧条件下比YHb具有更强生长促进作用的突变蛋白。

摘要： 本文为提高透明颤菌血红蛋白在限氧条件下促进宿主细胞生长的能力,首先通过易错PCR向透明颤菌血红蛋白基因中引入突变,再结合DNA改组对之进行改造。本研究将易错PCR与oHn改组相结合，对VHb进行改造，并将突变基因置于受氧调控的启动子之下进行表达和筛选，来筛选在限氧条件下比YHb具有更强生长促进作用的突变蛋白。

摘要： 本文为提高透明颤菌血红蛋白在限氧条件下促进宿主细胞生长的能力,首先通过易错PCR向透明颤菌血红蛋白基因中引入突变,再结合DNA改组对之进行改造。本研究将易错PCR与oHn改组相结合，对VHb进行改造，并将突变基因置于受氧调控的启动子之下进行表达和筛选，来筛选在限氧条件下比YHb具有更强生长促进作用的突变蛋白。

摘要： 本文为提高透明颤菌血红蛋白在限氧条件下促进宿主细胞生长的能力,首先通过易错PCR向透明颤菌血红蛋白基因中引入突变,再结合DNA改组对之进行改造。本研究将易错PCR与oHn改组相结合，对VHb进行改造，并将突变基因置于受氧调控的启动子之下进行表达和筛选，来筛选在限氧条件下比YHb具有更强生长促进作用的突变蛋白。

摘要： 为了获得中性或碱性条件下瑞氏木霉纤维素酶酶活提高的突变株,本文采用易错PCR技术和改错突变株技术建立了突变体文库.测序结果在321位的氨基酸由Asn转变为Thr.

摘要： 为了获得中性或碱性条件下瑞氏木霉纤维素酶酶活提高的突变株,本文采用易错PCR技术和改错突变株技术建立了突变体文库.测序结果在321位的氨基酸由Asn转变为Thr.

摘要： 为了获得中性或碱性条件下瑞氏木霉纤维素酶酶活提高的突变株,本文采用易错PCR技术和改错突变株技术建立了突变体文库.测序结果在321位的氨基酸由Asn转变为Thr.

摘要： 为了获得中性或碱性条件下瑞氏木霉纤维素酶酶活提高的突变株,本文采用易错PCR技术和改错突变株技术建立了突变体文库.测序结果在321位的氨基酸由Asn转变为Thr.

摘要： 本发明公开了基于易错PCR技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法，包括以下步骤：A1，获得突变内切葡聚糖酶基因；A2，内切葡聚糖酶大肠杆菌突变体库的构建；A3，高酶活菌株的筛选；A4，高酶活菌株突变基因的分析；实现了对来源于枯草芽孢杆菌C-36的内切葡聚糖酶基因进行体外定向进化，并在大肠杆菌中构建突变体库，筛选出一株酶活显著提高的菌株，为碱性内切葡聚糖酶的工业应用奠定了基础。

摘要： 本发明涉及人基因组DNA突变检测技术领域，具体涉及一种检测III类错合畸形PCDHB3基因突变的PCR引物、探针及方法，该PCR引物包括用于扩增PCDHB3基因多态位点的1对共2条引物；该探针包括用于检测PCDHB3基因多态位点的2条探针，每一条探针包含13‑25个碱基的序列，其5’端具有荧光基团标记，3’端具有MGB基团标记。本发明的PCR引物特异性好；本发明的探针特异性好，检测灵敏精确；本发明的荧光定量PCR检测方法可以检测III类错合畸形PCDHB3基因多态性，准确性好，灵敏度高，步骤简单，操作控制方便，检测效率高。

摘要： 本发明提供一种易错PCR技术及高通量筛选提高葡萄糖基转移酶EUGT11酶活的方法，包括以下步骤：a.EUGT11易错PCR扩增;b.易错PCR突变体库构建;c.高通量筛选酶活提高突变菌株；d.高酶活突变菌株序列分析。实现对大肠杆菌表达的葡萄糖基转移酶EUGT11基因进行定向进化，筛选得到提高葡萄糖基转移酶EUGT11酶活及可溶表达量的关键碱基突变位点。

摘要： 本发明公开了基于易错PCR技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法，包括以下步骤：A1，获得突变内切葡聚糖酶基因；A2，内切葡聚糖酶大肠杆菌突变体库的构建；A3，高酶活菌株的筛选；A4，高酶活菌株突变基因的分析；实现了对来源于枯草芽孢杆菌C-36的内切葡聚糖酶基因进行体外定向进化，并在大肠杆菌中构建突变体库，筛选出一株酶活显著提高的菌株，为碱性内切葡聚糖酶的工业应用奠定了基础。

摘要： 本发明涉及一种易错PCR/卡那霉素筛选系统定向进化蛋白质内含子的方法，包括：1)制备大量用于定向进化的载体；2)对蛋白质内含子进行易错PCR，然后与上述用于定向进化的载体连接并灭活，再经过浓缩转化感受态细胞，涂含有氨苄霉素和卡那霉素的双抗平板；3)对在上述双抗平板上生长的菌落进行菌液PCR验证，并以初步鉴定为阳性克隆获得其混合质粒作为下一轮易错PCR的模板，进行多轮易错PCR，即得。本发明能较灵敏地筛选剪接活性提高的蛋白质内含子，通过调整PCR体系各成分的配比，扩增出来大量的DNA片段，该方法获得的蛋白质内含子剪接活性高。

摘要： 本发明涉及一种利用不同程度的连续易错PCR进行定向进化的方法，包括：选择目的基因为模板设计引物；配制高、中、低不同程度的d[X]TP易错PCR体系；将配制好的PCR反应体系放入PCR仪中进行PCR扩增；将易错PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳回收，进行酶切、与载体连接、转化，进行阳性克隆筛选，提取质粒；以提取的质粒为模板，进行第二轮易错PCR；利用相应筛选系统进行有用突变的筛选。该方法操作简单，操作简单，突变频率高、产量稳定，可为定向进化蛋白质提供新的思路和途径。

摘要： 本发明涉及人基因组DNA突变检测技术领域，具体涉及一种检测III类错合畸形PCDHB3基因突变的PCR引物、探针及方法，该PCR引物包括用于扩增PCDHB3基因多态位点的1对共2条引物；该探针包括用于检测PCDHB3基因多态位点的2条探针，每一条探针包含13‑25个碱基的序列，其5’端具有荧光基团标记，3’端具有MGB基团标记。本发明的PCR引物特异性好；本发明的探针特异性好，检测灵敏精确；本发明的荧光定量PCR检测方法可以检测III类错合畸形PCDHB3基因多态性，准确性好，灵敏度高，步骤简单，操作控制方便，检测效率高。

摘要： 本实用新型公开了一种PCR孔板加样防错指示孔条，涉及实验辅助设备技术领域，其技术方案要点是：包括多个呈直线型分布的指示条体，每个指示条体均设有至少两个板孔，多个指示条体分别为不同颜色的板体。将指示孔条铺设在PCR孔板上，使得指示条体上的板孔与PCR孔板的试孔一一对应，每一个指示条体上做一个实验，并依据指示条体之间的颜色加以区分与辨别，且通过每一个指示条体上的多个复孔可重复操作，从而减少由于孔数多、孔径和孔间距小而造成的遗漏、重复或错行等失误，显著缩短PCR孔板的加样时间，降低样本暴露时间，提高实验准确度和可重复性，该辅助性的加样防错指示孔条成本低廉，可反复使用，操作简单易行，显著提高上样率。

摘要： 本实用新型公开了一种96孔PCR板用防止错行的装置，包括箱子主体和PCR板，所述箱子主体的底部内壁滑动连接有抽屉，所述抽屉的底部内壁均匀安装有多个隔板，所述箱子主体的两侧内壁固定安装有同一个固定板，所述固定板的顶部开设有通孔，所述固定板底部设有发光组件，所述箱子主体的顶部放置有PCR板，本实用新型结构简单，通过第三横板、第一圆柱、第二圆柱和拉簧的相互作用来实现第三横板的转动和纵向移动，来实现对PCR板的夹紧作用，通过带灯开关、指示灯和固定板的相互作用来给予添加指示，从而确保添加准确无误，通过弹簧、拉杆和卡柱的相互作用来实现对抽屉的固定，从而实现对样品的冷却。

摘要： 本实用新型公开了一种用于自动化工作站的防错96孔PCR板架，属于生物检测技术领域。本实用新型提供的用于自动化工作站的防错96孔PCR板架，包括主体和防错棱，所述主体由8行x12列的96个孔和框架组成。本实用新型的适用于自动化工作站的防错96孔PCR板架，通过将一个三角棱设置于96孔PCR板架的一角，以配合常规96孔PCR板的缺角，可有效防止操作过程中出现96孔板放置方向的错误，大大减少人为造成的损失。